果胶酶高产菌微紫青霉SW09的鉴定及发酵特征.docx

果胶酶高产菌微紫青霉SW09的鉴定及发酵特征 摘要：从云南烟田采取土样多份，以果胶为惟一碳源，通过初筛和摇瓶复筛，筛选到l株果胶酶高产真菌SW09。通过菌落形态观察、生理生化指标试验和l8S rDNA保守序列分析，经初步鉴定为微紫青霉，将其命名为Penicillium janthinellum SW09，并以发酵罐深层液体培养确定其发酵生长周期为72 h，产聚半乳糖醛酸酶活力最大达到3 071.99 U/mL，为烟梗果胶质的生物降解奠定基础。 关键词：聚半乳糖醛酸酶；微紫青霉；生长周期 中图分类号：Q946.5；Q93-331 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）02-0337-04 DOI：10.14088/j.c; word-spacing: 0px; text-transform: none; color: rgb(51,51,51); text-align: left; font: 16px/28px 微软雅黑, Helvetica; letter-spacing: normal; text-indent: 0px; -webkit-text-stroke-width: 0px / 果胶酶是由多种组分组成的复合酶，多种组分协同完成果胶的降解。天然来源的果胶酶广泛存在于动植物和微生物中，但动植物来源的果胶酶产量低，难于大规模提取制备，微生物因具有生长速度快、生长条件简单、代谢过程特殊和分布广泛等特点而成为果胶酶的重要来源，因此微生物是生产果胶酶的优良生物资源2-5。果胶酶广泛应用于食品工业、饲料工业、造纸工业和纺织工业中，由于一般果汁的自然pH为3.04.0，所以食品工业的果胶酶多为酸性果胶酶。 聚半乳糖醛酸酶是果胶酶的最重要组分，专一性地分解果胶质中2个非酯化半乳糖醛酸间的糖苷键，使果胶很快从大分子降解为分子量较小的低聚糖类，因此，聚半乳糖醛酸酶的活力在很大程度上代表了果胶酶的活力。果胶酶制剂的工业化生产始于20世纪50年代，主要生产国有德国、法国、意大利、丹麦、荷兰、日本等。这些国家在陆续解决了菌种、发酵方法、制剂方法等问题后，果胶酶制剂得到了规模化生产。目前中国已能生产果胶酶，但是纯度和活性都不高。因此，选育高产菌株来提高聚半乳糖醛酸酶的产率和降低产酶成本，对研究开发和应用聚半乳糖醛酸酶具有重要的意义。本研究以果胶为惟一碳源，通过初筛和摇瓶复筛，筛选果胶酶高产菌株并对其液体发酵进行研究，为大规模发酵产果胶酶提供方法借鉴。 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 土样 土样由郑州轻工业学院食品与生物工程学院重点实验室从云南省烟田采集的土壤中分离得到。 1.1.2 培养基 分离培养基：果胶5.0 g/L，NaNO3 3.0 g/L，FeSO4 0.1 g/L，MgSO4 0.5 g/L，KH2PO4 0.1 g/L，琼脂25.0 g/L，pH 5.8。 定性验证培养基：2%果胶琼脂培养基。 液体种子培养基：果胶5.0 g/L，酵母粉10.0 g/L，FeSO4 0.1 g/L，MgSO4 0.5 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，pH 6.0，装液量100 mL于250 mL锥形瓶。 基础液体培养基：葡萄糖30.0 g/L，蛋白胨3.0 g/L，果胶0.5 g/L，pH 6.0。 1.1.3 主要试剂和仪器 3，5-二硝基水杨酸（DNS，天津市华东试剂有限公司）；果胶粉（天津市风船化学试剂有限公司）；D-半乳糖醛酸标准品（97%，Sigma-Aldrich公司）；PCR系列试剂2Taq MasterMix（含染料，北京康为世纪生物科技有限公司）；UNlQ-10柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工生物工程有限公司）。 BS200S型电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；SN-CJ IFD型双人双面超净化工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；UV-17001C型紫外分光光度计（上海凤凰光学科仪有限公司）；HH-4型电热数字恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；CF-16RX型冷冻离心机（Hitachi）；SFLY-100B型台式小容量恒温培养摇床（上海申贤恒温设备厂）；SPX-160B-2型恒温培养箱（上海福玛实验设备有限公司）。 1.2 试验方法 1.2.1 果胶酶生产菌的分离及菌落形态特征 用稀释平板法处理土壤样品，单孢分离法分离纯化目的菌株。采集的土样分别溶解到生理盐水中，静置2 h，吸取上清液，分别稀释到10-3、10-5、10-7并涂布于筛选平板上，28 培养2 d，挑取经刚果红染色产生较大透明圈单菌落的真菌单个孢子至定性培养基中，于2830 生化培养箱内培养47 d，挑取单菌落，获得纯菌种，无菌操作。对初筛的结果进行摇瓶复筛扩大培养，采用DNS法测定聚半乳糖醛酸酶活力，选取果胶酶活性高的菌株进行菌落、形态观察和菌株鉴定，培育出高产菌株。 1.2.2 聚半乳糖醛酸酶（PG）活力测定方法 参照Miller（1959）的方法。取0.4 mL 1%果胶溶液于试管中，加入1.0 mL pH 5.0的0.04 mol/L Na2HPO4-0.02 mol/L柠檬酸缓冲液，45 水浴平衡5 min。加入0.1 mL适当稀释的酶液，45 反应30 min（空白对照组以煮沸失活的酶液代替），加入3.0 mL DNS溶液终止反应，沸水浴5 min，冷却，定容至15.0 mL，540 nm 波长下用分光光度计测吸光度，得到反应体系中半乳糖醛酸的量。酶活力单位：1 mL酶液在45 、pH 5.0的条件下，每分钟分解底物产生1 μg半乳糖醛酸的酶量定义为1单位聚半乳糖醛酸酶（PG）酶活，以U/mL表示。 酶活力计算公式：U=（C试验-C对照）N1 000（V总/V酶）/t。其中，C试验和C对照分别代表试验组和对照组的吸光度，N为酶液稀释倍数，V总为反应总体积，V酶为酶液体积，t为反应时间（min）。 DNS法标准曲线的绘制：配置1.0 mg/mL的半乳糖醛酸标准溶液，取1.0 mg/mL 半乳糖醛酸溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于试管中，补水至1.0 mL，加DNS 试剂3.0 mL，混合后于沸水中煮7 min，冷却后定容至15.0 mL，于540 nm 波长下用分光光度计测定吸光度。以吸光度为纵坐标，半乳糖醛酸量为横坐标，绘制标准曲线。1.2.3 DNA的提取和ITS PCR扩增 将单菌落接种于液体培养基，28 培养2 d，离心取菌丝体冷冻干燥，将干燥的菌丝体经液氮碾磨成细粉，用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒进行DNA的提取。将得到的DNA用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测：TAE电泳缓冲液，电压110 V，电泳时间25 min。ULTRA-LUM OMEGA 10凝胶成像系统下观察照相。以DNA为模板，通过引物ITS1（5′-TCCGTA GGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′）参照White等的方法进行PCR扩增，PCR反应体系为：2Taq MasterMix 10.0 μL，DNA模板1.0 μL，ITS1 0.5 μL，ITS4 0.5 μL，去离子水 8.0 μL。PCR反应程序为：94 预变性300 s；94 变性45 s；55 退火50 s；72 延伸60 s，33个循环；最终72 充分延伸300 s。取5 μL PCR样品凝胶电泳20 min，EB染色。在凝胶成像系统中观察提取DNA的质量并照相记录。将有条带的PCR原液送上海生工生物工程有限公司测序。 1.2.4 ITS序列测定及系统发育分析 将菌株的ITS基因序列提交到NCBI的GenBank核酸序列数据库并与数据库中已知的相关序列进行比对，并用MEGA 3.1构建系统发育树。 1.2.5 最适培养时间的确定及形态学观察 5 L的发酵罐装入基础培养基4 L，离位灭菌后冷却、接种。设置发酵罐控制参数：温度28 ，搅拌速度150 r/min，进气量2 m3/（m3min）。自接种开始，每隔24 h取样一次。测定其菌丝产量和PG酶活力，确定其最佳培养时间。取平均大小的菌丝球若干，加入等体积固定剂（200 mL 50%乙醇，13 mL 40%甲醛，5 mol/L冰醋酸），用染色剂（0.39%亚甲基蓝，30 mL 95%乙醇，100 mL蒸馏水）染色24 h后制片，在40倍下显微拍照观察，采用DT2000图像分析软件分析不同发酵时间菌丝球的性状。其中，紧密度=菌核面积/菌丝球面积，粗糙度=（菌丝球的周长）2/（面积4π）。 2 结果与分析 2.1 产果胶酶菌株的筛选及形态观察 从所采集的土样中共分离得到产果胶酶的真菌14株，挑取到定性验证培养基上纯化培养，选取出经过刚果红染色产生的透明圈直径较大的菌株6株进行摇瓶复筛，经测定选取出一株产果胶酶活力最高的真菌，命名为SW09。培养4 d即形成较典型的菌落，菌落中间呈黄色，边缘为白色，直径约19.0 mm，轮廓规则（图1A、图1B）。其菌落呈毡状，表面絮状，有放射状褶裂，产孢面为黄色，后期菌落顶端转至淡粉色或淡紫色，背面无色至黄色转橙色，至淡紫色（图1C）。小梗少而细，长8.010.0 μm，宽2.02.2 μm，顶端急剧地变细（图1D）。分生孢子为椭圆形，一端或两端稍尖，其长径约3.03.5 μm。 2.2 18S rDNA的序列测定 用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒进行DNA的提取，琼脂糖凝胶电泳结果表明，SW09菌株基因组DNA条带明亮且清晰（图2A），可以很好地用于PCR扩增。应用ITS1和ITS4引物对DNA进行PCR扩增，能扩增出比较明亮的条带且条带清晰、完整（图2B），表明扩增的ITS区段大小在560 bp左右。 2.3 系统发育分析 根据基因库比对结果，在GenBank中下载相近分类元的ITS序列，用Clustal X软件对这些序列和青霉菌的序列进行初步比对。利用MEGA 3.1软件进行多重序列比对并绘制系统发育树（图3）。进化分析结果表明，SW09菌株与多数青霉属的真菌具有较近的亲缘，其中与微紫青霉（Penicillium janthinellum P49）的亲缘关系最近，相似性为99%，因此鉴定此菌株为微紫青霉，命名为Penicillium janthinellum SW09。 2.4 最适培养时间的确定及形态学观察 2.4.1 半乳糖醛酸标准曲线 根据1.2.2的试验方法，以半乳糖醛酸的浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得到的线性方程为：y=0.772 3x-0.024 5，R2=0.995 1。 2.4.2 最适培养时间的确定 根据发酵罐培养时间内Penicillium janthinellum SW09菌丝干重及产酶量的变化（图4）。将菌体从种子培养基中接入摇瓶培养基后024 h菌丝生长，菌体进入对数期；其后曲线趋于平缓，从24120 h是菌体的稳定期；120 h后菌体开始自溶，进入衰亡期。确定最佳培养时间为72 h，此时目标产物酶活力达到最大值，为3 071.99 U/mL。基础培养基的pH在72 h内先略有上升，之后平缓下降（图4）。残糖含量一直平稳下降，72 h左右残糖量下降幅度不明显，可能是由于微生物代谢糖的产生引起，具体机理有待研究。 2.4.3 形态学观察 Penicillium janthinellum SW09不同发酵时间菌丝球形态变化和菌丝