维生素类药物的分析课件

药物分析学（第14章）,维生素类药物的分析（1）,本节教师： 韩海 （博士/副教授 ) 暨南大学药学院 Tel:E-mail: QQ: 56011856,2013.10.30,维生素类药物的分析,基本内容 维生素A、维生素B1、维生素C、维生素D和维生素E的结构和性质、鉴别试验、含量测定，以及游离生育酚的检查。 基本要求 掌握：维生素类药物的结构与分析方法的关系，维生素A的紫外分光光度法，维生素C的碘量法。,维生素类药物的分析,熟悉：维生素A的三氯化锑反应及比色法，维生素E的鉴别试验及气相色谱法，维生素B1的硫色素反应及紫外分光光度法、非水滴定法，维生素C的2，6二氯吲哚酚滴定法，维生素D的鉴别试验。 了解：该类药物的其他分析项目与方法，维生素D含量测定的高效液相色谱法，维生素A三点校正法的推导过程 。,课时安排： 总学时： （5学时） 维生素A、维生素B1 （3学时） 重点内容：维生素A的紫外分光光度法 维生素C、D、E； 复习及习题（2学时）,概 述,特点： 1.非蛋白质、非脂肪、非糖类的有机化合物.具有较强的生理活性，体内不能合成。 2.多为醇、酯、胺、酸、酚和醌类；各具不同的理化性质和生理作用。,维生素A (retinal),维生素D3 (colecalciferol，胆骨化醇),维生素B1 (Thiamine hydrochloride,盐酸硫胺),3.分类:脂溶性和水溶性 脂溶性：维生素A、D、E、K等； 水溶性：维生素B组(B1、B2等)、烟酸、泛酸、叶酸及抗坏血酸。 其中脂溶性维生素在体内可直接参与代谢的调节作用，而水溶性维生素是通过转变成辅酶对代谢起调节作用。 4. 测定方法: 生物、微生物、化学和物理化学的方法.,第一节 维生素A的分析,维生素A 主要存于动物性食物中，但有色植物中的-胡萝卜素即VA原含量丰富。,第一节 维生素A的分析,维生素A 维生素A1（视黄醇） 维生素A2（去氢维生素） 维生素A3 （去水维生素） 全反式维生素A,一、结构与性质,维生素A (retinal),1共轭多烯结构： 具有强紫外吸收（在325328nm有最大吸收），可采用紫外吸收光谱法进行鉴别，采用紫外分光光度法进行含量测定。 存在多种立体异构化合物 天然维生素A是全反式维生素A。其它异构体具有相似的化学性质，但生物效价不同。 （表9-2）,相对生物效价,维生素A （全反） 325.5 100% 新维生素Aa （2-顺） 328 75% 新维生素Ab （4-顺） 320. 5 24% 新维生素Ac （2、4-顺） 310.5 15% 异维生素Aa （6-顺） 323 21% 异维生素Ab （2、6-顺） 324 24%,一、结构与性质,2.结构式中R的不同，可以形成维生素A醇或其酯。临床上多用其醋酸酯和棕榈酸酯。（表14-1） 3.易氧化变质：有多个不饱和键，性质不稳定，易被空气中氧或氧化剂氧化，生成无活性物质。,-H 维生素A醇 -COCH3 维生素A醋酸酯 -COC15H31 维生素A棕榈酸酯,R :,去氢维生素A （A2 dehydroretinol),去水维生素A （A3 anhydroretinol),一、结构与性质,4.溶解性：（脂溶性）能与氯仿、乙醚、环己烷或石油醚任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶。 5.能与三氯化锑呈色 ：在氯仿中能与三氯化锑试剂作用，产生不稳定的蓝色。,二、鉴别试验, （一）三氯化锑反应（Carr-Price反应） 维生素A在饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液中，即显蓝色，渐变成紫红色。,SbCl5,二、鉴别试验,讨论： 1.实际起作用的是三氯化锑()中存在的Lewis酸氯化高锑(V) 2.反应要用无醇氯仿，因为醇的存在要作为亲核反应物与正碳离子反应而使其正电荷消失。 3.反应要无水，水可使三氯化锑水解为氧氯化锑。, （二）紫外吸收 特征：1. 直接测定维生素A1 在326nm处有最大吸收。 2.酸消去后测定维生素A3（去水维生素A） 在332nm附近有曲折， 在348、367、389nm附近有吸收峰。 1、为什么吸收带红移？ 2、为什么吸收峰变多？,二、鉴别试验,Vit A,Vit A3,维生素A(醇)在盐酸存在下解离，随即正电荷转移至紫萝酮环上的碳上，然后失去一个质子而生成去水维生素A：,1、为什么吸收带红移？ 去水维生素A比维生素A多一个共轭双键，因而红移。 Konjugierte吸收 Fieser规则、 Scoot规则 2、为什么吸收峰变多？ （思考题，请查询紫外光谱原理的相关资料）,（三）薄层层析 条件1：（BP2000） 硅胶板 溶剂：环己烷 展开剂：环己烷乙醚（80:20） 三氯化锑试剂显色，以标准品同时进行对照 条件2： 硅胶板 溶剂：氯仿 展开剂：环己烷乙醚（80:20） 磷钼酸显色，以标准品同时进行对照,三、含量测定,维生素A的测定CHP收载三种,HPLC法,UV,三氯化锑法,三、含量测定, 紫外分光光度法 三氯化锑比色法 （专属性差，显色不稳定） 前者是法定方法，后者多用于食品或饲料中的维生素A的测定（行业方法）。 HPLC法 具有强紫外吸收（在325328nm有最大吸收），可采用紫外分光光度法进行含量测定。, 紫外分光光度法,目前各国药典均采用紫外分光光度法测定维生素A的含量。本法快速、准确、经济，测定结果能比较正确地反映维生素A的效价。 如何测定？ 1.根据紫外光谱数据: 定量 维生素A在不同溶剂中的紫外吸收数据,其最大吸收峰的位置随溶剂的不同而异,2.能否直接测定 ？ 能直接测定 的条件： 1.仪器符合药典的要求 2.溶剂及样品中的基质等其他组分在测定波长处无干扰 （1）而维生素A原料药中常混有杂质，如维生素A2、维生素A3。,（2）维生素A的氧化产物：,（3）维生素A在光照下产生的 无生物活性的聚合物鲸醇：,（4）维生素A的顺反异构体； （5）合成时产生的中间体 这些杂质在维生素A的最大吸收波长（310340nm）波长范围内有吸收，干扰维生素A的测定，所测得的吸收度不是维生素A所独有。,所以不能直接测定维生素A的 用于定量 要消除杂质的干扰 三点校正法, 三点校正法测定维生素A的含量,本法是用在三个波长处测得吸收度，根据校正公式计算吸收度A校正值后，再计算含量。 原理 ： 杂质的吸收在310340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大，吸收度变小。 物质对光的吸收度具有加和性，因而吸收曲线也是他们吸收曲线的叠加。,原则 ：最大吸收波长处一点，最大吸收波长的两侧各选一点。 1.中国药典测定维生素A醋酸酯等波长差法 在 1的左右各选一点为 2和 3；使 3 11 2。 规定 1328nm， 2316nm， 3340nm,2.中国药典测定维生素A醇等吸收比法 在 1的左右各选一点为 2 和 3； 使A 2A3=6/7A 1。 规定 1325nm， 2310nm， 3334nm,第一法：测定维生素A醋酸酯的方法等波长差法 基本思想：先判断杂质的干扰是否影响测定及影响程度（五点波长法），再决定用哪个吸收度进行含量计算。 1.取维生素A醋酸酯，精密称定，加环己烷制成每1m1中含915单位的溶液。然后在300、316、328、340、360nm五个波长处分别测定吸收值。,测定方法中国药典,2. A值的选择法: 按中国药典附录 J维生素A测定法的规定。 计算各波长下的吸收度与 328nm波长下的吸收度的 比值。并确定最大吸收波长 (应为328nm)。,五个吸收度比值分别与规定的吸收度比值相减，即得到五个差值。判断每个差值是否超过规定的0.02。,1.理想状况:杂质几乎没有形成干扰。 判断标准：最大吸收波长在326329nm之间，计算吸收度比值Ai /A328，并与规定值相减，差值不超过0.02 A值选择：选择A328计算含量 2. 非理想状况:杂质有干扰。 判断标准（符合以下两点之一） (1) 最大吸收波长在326329nm之间，5个波长下的Ai /A328与规定值之差有一个或几个超过0.02 ； (2)最大吸收波长不在326329nm之间 。,A值选择： 先计算出： 再计算出 再根据以下三种不同情况选择 （1）若所得的数值在3%，表明杂质干扰很小，则仍用A328计算含量； （2）若所得的数值在-15%-3%之间，表明杂质有一定的干扰，则需用A328（校正）计算含量；,如何计算标示量的百分含量？ 第二步：求 第三步：求效价（IU/g）：效价系指每克供试品中所含维生素A的国际单位数。 如何换算成效价（IU/g）？ 换算因子：定义为每1个 数值所相当的效价。,（C单位为g/100ml）,VitA的标示量为效价！,1g维生素A醋酸酯相当的国际单位数为：, 效价IU/g = E 1cm1% 1900(溶剂:环己烷),1g维生素A醇相当的国际单位数为：, 效价IU/g = E 1cm1% 1830(溶剂:环己烷),第四步：求标示量 标示量样品标签上注明的每胶丸含有的维生素A醋酸酯的国际单位数(效价，非含量！) 1.求维生素A醋酸酯胶丸为标示量的百分含量: IU/丸 标示量% =- 100% 标示量 IU/丸 = IU/g g/丸 = IU/g W IU/g W 标示量% = - 100% 标示量,测定含量,单位质量1g对应的效价,效价占单位样品质量的百分比,效价（标示）占单位质量的百分比,或者： A直接测得的A328或校正后的A328 (校正)； D供试品的稀释倍数； 1900换算因数； W胶丸的平均内容物重量，g； W称取供试品取量，g； l比色池厚度，cm； 标示量样品标签上注明的每胶九含有的维生素A醋酸酯的国际单位数。,（3）若所得的数值小于-15%或大于+3%，或最大吸收波长不在326329nm之间，表明杂质干扰很大，已经不适宜再用本法测定。则应采用第二法（皂化法）测定。 图示：,用第二法测,定,用,A328,（校正,）,计算,用,A328,计算,用第二法测,定,-,15,%,-,3%,0,+3%,第二法：中国药典适用于维生素A醇（含杂质较多的维生素A ）的方法 等吸收比法、6/7A法,第一法无法消除杂质干扰时用此法,2. A值的选择法: 按中国药典附录 J维生素A测定法的规定。,判断max是否在323327nm之间,计算,是,否,取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定,判断 A300 /A325 是否大于0.73,是,否,取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定,计算A325(校正),0,3%,3%,如何计算含量？ 1.求E 1cm1% E 1cm1% =A/CL （C单位为g/100ml） 2.求效价（IU/g）： IU/g= E 1cm1% 1830 3.求维生素A醇为标示量的百分含量: IU/丸 标示量% = - 100% 标示量 IU/丸 = IU/g g/丸 = IU/g W IU/g W 标示量% = - 100% 标示量,A直接测得的A328或校正后的A328 (校正)； 1830换算因子； D供试品的稀释倍数； W胶丸的平均内容物重量，g； W称取供试品取量，g； l比色池厚度，cm； 标示量样品标签上注明的每胶九含有的维生素A醋酸酯的国际单位数。, 关于三点校正法测定维生素A 含量方法的讨论,1）维生素A醋酸酯的吸收度校正公式是用直线方程式法（即代数法）推导而来： 维生素A醇的吸收度校正公式是用相似三角形法（几何法或6/7定位法）推导而来。（了解）, 关于三点校正法测定维生素A 含量方法的讨论, 2）在应用三点校正法时，除其中一点在最大吸收波长处测定外，其余两点均在最大吸收峰的两侧进行测定。如果仪器波长精度不准确时，会产生较大误差。因此： 在测定前务必要校正波长， （ChP，Appendix IV A） 可用全反式维生素A进行测定， 比较测定结果和比值是否与对照品 相符合，以进一步核对仪器波长是 否准确。 测定的样品应不得少于两份。, 关于三点校正法测定维生素A 含量方法的讨论,3）皂化后提取应避免强烈振动以免引起乳化。皂化的全部过程应连氮并应在最短时间内完成。标准品及样品的处理，应避免接触金属器皿。 4）不适宜用第一法测定的维生素A醋酸酯。改用第二法（皂化法）测定后。其换算因子也相应改为维生素A醇的换算因子1830，计算时必需注意！ 5）中国药典收载的维生素A胶丸、维生素AD滴剂、维生素AD胶丸等均采用三点校正法测定。,应用示例一,VitAD胶丸中VitA的含量测定,精密称取本品(规格10,000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.07985g/丸）的内容物 0.1287g 至50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一50 ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度如下，计算Vit A的标示量百分含量。,A=A328校正,维生素A的HPLC法（请自学）,色谱条件正相色谱法！,色谱柱：硅胶柱 流动相：正己烷-异丙醇（997:3) 检测波长 325 nm 外标法：Vit A 酯,维生素A的三氯化锑比色法,原理：维生素A与三氯化锑的无水氯仿溶液作用，产生不稳定的蓝色， max 618nm620nm ，符合Beer定律。 方法：标准曲线法。 特点： 1.需在510秒钟内测定。呈色不稳定 2.受温度影响很大 3.需要无水条件 4、三氯化锑有腐蚀性,5.非专属反应；如新维生素A 、去水维生素A及胡萝卜素等物质，均与三氯化锑均显蓝色，故在测定天然维生素A时，测定值往往偏高. 6.简易，操作迅速。目前仍为食品或饲料中维生素A测定常用的方法。,第二节 水溶性维生素维生素B1的分析,VB1又称盐酸硫胺素，是由一个噻唑环和氨基嘧啶环通过亚甲基连接而成的季铵化合物。 在生物体内主要以焦磷酸硫胺素（TPP）形式存在。 VB1和糖代谢关系密切，当缺乏时造成丙酮酸积累易引起神经炎和脚气病。,氨基嘧啶环,噻唑环,亚甲基,季铵,亦称盐酸硫胺,具有维持糖代谢及神经传导与消化的正常功能，主要用于治疗脚气病、多发性神经炎和胃肠道疾病,一、结构及性质, 结构特点： 1氨基嘧啶环和噻唑环：具有硫色素反应，此反应专属性强，用于鉴别和含量测定。 2. 母核具N杂环，有弱碱性， 1）可以与生物碱沉淀剂反应，产生沉淀，用于鉴别与含量测定。 2）可以在冰醋酸中与高氯酸定量反应，用于含量测定。 3共轭体系：具紫外吸收，用于含量测定。 4盐酸根：呈氯化物的反应，用于鉴别。,一、结构及性质, 理化性质 (1)溶解性 本品在水中易溶，水溶液显酸性反应。在乙醇中微溶，在乙醚中不溶。 (2)具有紫外吸收 本品约12.5 gm1盐酸溶液(91000)，max = 246nm，百分吸收系数为406436。 (3)在碱性中遇氧化剂，如铁氰化钾，可被氧化为具有荧光的硫色素，后者溶于正丁醇中呈蓝色荧光。,(4)分子中含有两个杂环(嘧啶环和噻唑环)，故可与某些生物碱沉淀试剂(如碘化汞钾、三硝基酚、碘溶液、硅钨酸等)反应生成组成恒定的沉淀。 (5)水溶液呈氯化物的反应，用于鉴别。 (6)干燥品很稳定，酸性水溶液稳定，在碱性溶液中，噻唑环开环，迅速分解。,二、鉴别试验, (一)硫色素反应 硫色素反应为维生素B1所特有，中国药典以此进行鉴别。 (1)原理 (2)方法 取本品约5mg，加氢氧化钠试液2.5m1溶解后，加铁氰化钾试液0.5m1与正丁醇5m1，强力振摇2min，放置分层，上面的醇层显强烈的蓝色荧光。加酸使成酸性，荧光即消失。再加碱使成碱性，荧光又显出。,(二)沉淀反应 (1) (2) (3) (4)与苦酮酸作用形成不溶于水的扇形两头弯成螺旋状的白色结晶。其他维生素与苦酮酸不发生反应！,嘧啶环 伯氨,噻唑环 季铵,H+,H+,（三）加碱分解后与醋酸铅反应 水溶液加醋醋铅试液和氢氧化钠试液并加热，溶液由黄色棕色最后生成黑色沉淀。 苛性碱分解维生素B1，产生的硫化钠与醋酸铅作用生成黑色硫化铅沉淀。,S元素反应,（四）水溶液显氯化物的特殊反应,Cl-反应,三、含量测定,方法种类： 硅钨酸重量法、BP（1998） 硫色素荧光法、USP（24） 非水溶液滴定法、 （Chp 测定维生素B1原料药） 紫外分光光度法。 （Chp 测定维生素B1制剂）,1硅钨酸重量法简介 BP（2000）、Chp（1990）方法 维生素B1在酸性溶液中与硅钨酸作用产生沉淀，根据沉淀的重量即可计算其含量。 特点：原理简单，但操作繁琐费时， 试剂易得， 结果较为准确。,MW：3479.22,2.硫色素荧光法 p222 USP（24）方法 原理: 盐酸硫胺在碱性溶液中，被氧化剂（如铁氰化钾）氧化生成硫色素，用异丁醇提取，在紫外光照射下呈现蓝色荧光，与已知浓度的标准品溶液所得荧光进行比较或测定荧光强度，可求得供试品中B1的含量。,方法：教材P260 1. 铁氰化钾溶液要新配 2.标准品、供试品逐步定量稀释 3.标准品、供试品各测定两份以上,取均值定量。并与空白试验校正。,讨论 1.硫色素反应为维生素B1所特有，为高专属性反应。适用于维生素B1制剂的含量测定. 2.反应非定量完成，但在一定条件下，形成的硫色素与维生素B1浓度成正比. 3.操作繁琐费时,