超声提取草莓茎叶中原花青素的工艺研究毕业论文.doc

*大学本科毕业论文超声提取草莓茎叶中原花青素的工艺研究学生姓名院系名称专业名称班 级学 号 指导教师 *大学教务处 二一四年五月超声提取草莓茎叶中原花青素的工艺研究*专业指导教师：* 作者:*摘 要：研究草莓茎叶中原花青素的超声提取工艺条件。通过单因素试验分析超声提取过程中料液比、乙醇浓度、提取次数、提取时间和提取温度五个因素对原花青素提取率的影响，在单因素试验的基础上，采用L8(27)正交优化试验，对提取工艺进行了优化。结果表明：各因素对原花青素提取效果的影响大小顺序为： 提取次数 乙醇浓度 料液比温度提取时间；超声波提取法的适宜提取条件为：乙醇浓度40%、提取时间15min、提取温度30、料液比1:15、提取次数3次，原花青素的得率最高。该方法优选出了草莓茎叶中原花青素的最佳超声提取工艺条件，为草莓茎叶的开发利用提供了依据。关键词：草莓茎叶 超声提取 原花青素 正交优化Study on Extraction of Procyanidins from Strawberry Stem and Leaves with Ultrasonic Major: biotechnologyWritten by Liu Houlu Supevrised by Prof.Zhang XiaoyuAbstract: To study the extraction conditions for procyanidine from Strawberry stem and leaves. Methods Effects of solid-liquid ratio, ethanol concentration, extraction times, extraction time and temperature on the content of procyanidine were studied by single factor test. Based on the single factor test, extraction technology was optimized by L8(27) orthogonal test. Results The influence factors of on the extraction rate of procyanidine were as follows: extraction times ethanol concentration solid-liquid ratio extraction temperature extraction time. The optimum conditions were as follows: the ethanol concentration was 40%, solid-liquid ratio was 1: 15, extraction temperature was at 30, extracted for 15min and each for 3 times.Conclusion The optimal condition was obtained for the ultrasonic extraction of procyanidine,which provided references for the development and utilization of Strawberry stem and leaves.Key words: Strawberry; Stem and leaf; Ultrasonic extraction; Procyanidine; Orthogonal test目录摘 要IAbstractI第一章 文献综述11草莓概述11.1草莓种属及分布11.2草莓植物生物特征11.3草莓种植现状11.3.1草莓种植方式11.3.2草莓种植规模22 草莓植物有效成分研究现状23原花青素概念、活性概述33.1原花青素结构及分布33.2原花青素的理化性质33.3原花青素的生物学作用43.3.1 抗氧化抗衰老43.3.2抗突变、抗癌变43.3.3抗炎活性53.3.4抗菌、抗病毒53.3.5其他生物学活性54 原花青素提取方法54.1 有机溶剂提取64.2 微波辅助提取法64.3 酶辅助提取法64.4 超声波辅助提取65 论文背景及意义7第二章 超声提取草莓茎叶中原花青素的工艺研究81实验材料、试剂与设备81.1实验材料81.2实验试剂81.3实验设备82实验方法82.1 标准曲线建立方法82. 2 样品测定82.3单因素试验92.3.1 提取温度对原花青素含量的影响92.3.2乙醇浓度对原花青素含量的影响92.3.3 料液比对原花青素含量的影响92.3.4 提取时间对原花青素含量的影响92.3.5 提取次数对原花青素含量的影响92.4草莓茎叶原花青素提取条件的优化103 结果与分析103.1 标准曲线的绘制103.2 单因素试验对草莓茎叶中原花青素原花青素含量的影响113.2.1 提取温度的选择113.2.2 乙醇浓度的选择123.2.3料液比的选择143.2.4 提取时间的选择153.2.5提取次数的选择163.3 正交优化试验结果分析174 讨论17参考文献18致谢22III第一章 文献综述1草莓概述1.1草莓种属及分布草莓是蔷薇科草莓属多年生草本植物。世界草莓属植物（Fragaria）约有 20 个常见种，主要分布于欧洲、美洲和亚洲。中国是世界上野生草莓种类最丰富的国家，我国自然分布有 11个种1。这11个种包括8个二倍体种：裂萼草莓(F. daltoniana Gay)、黄毛草莓 (F. nilgrrensis Schlecht.)、绿色草莓 (F. viridis Du-ch. )、森林草莓 (Fragaria vesca L.)、纤细草莓 (F. gracilis Lozinsk.)、西藏草莓 (F. nubicola Lind.l) 、 东北草莓 (F. mandschurica Staudt)、五叶草莓 (F. pentaphyl-la Lozinsk.)和3个四倍体种: 伞房草莓 (F. corymbosa Lozinsk.)、西南草莓F. m-oupinensis (Franch.)Card.、东方草莓 (F. orientalis Lozinsk.)。其中适合在四川栽种的种类有三种：纤细草莓 (F. gracilis Lozinsk.)、森林草莓 (Fragaria vesca L.)、西南草莓 (F. moupinensis (Franch)Card.)2。1.2草莓植物生物特征草莓为浅根系植物，根系主要存在于分 1520 厘米左右土层里，只有少数根系深达 40 厘米以下。富含有机质通气好的沙质壤土地最适合其生长，无机盐离子含量过高、干旱或湿涝的土地都不适宜栽培草莓。草莓根系活动早于地上部分，温度在 25的春季时，根系就开始活动，在-8可能受到冻害，-12左右时几乎全部冻死2。草莓对水反应十分敏感，较高的土壤湿度和空气湿度是其正常生长必不可少的条件。特别是花期后果实迅速膨大时期，需要种植环境中含有较高的水分。草莓比较喜好阳光，但也耐荫，栽植密度过大容易使花序盖在叶层下面，因得不到光照和授粉不良而导致草莓败育2。草莓是常绿植物，从晚秋到初冬的自然条件下北方草莓被迫休眠，叶柄会变短，叶面积随之变小，即使在休眠期，只要温度不在受冻害范围，草莓也能开花结果，只有很少发育为成熟果实。其实休眠中的草莓，并没有完全停止生长发育，这是其显著生物特征3。1.3草莓种植现状1.3.1草莓种植方式草莓果色泽红艳, 柔嫩多汁,甜酸可口，营养丰富，草莓汁、草莓酱、草莓罐头等加工制品，更是脍炙人口。草莓也是一年中上市最早的水果，随着迅速发展的各种形式栽培技术，草莓供应期自 1 月份一直延长到 6 月份，其适应性很强，世界各国几乎都有栽培。近年来，草莓栽培技术惊人发展的程度使得草莓经济效益高且稳定。同时为了满足和地区种植要求，其栽培形式正趋向多样化、复杂化3。中国草莓栽培形式主要有：露地栽培、小拱棚半促成栽培、普通大棚促成栽培。另外，还有普通大棚抑制栽培、塑料日光温室半促成栽培等。这些方式都是与全国各地不同日照和温度一系列条件应运而生的4。1.3.2草莓种植规模据王忠国对世界草莓发展状况分析可得知：截止2012年世界草莓栽培面积远超过30 万公顷，年生产量也已超过450 万吨。在世界各大洲中，草莓产量最多的是亚洲，约占世界的42%，主要分布地区有土耳其、中国、伊朗、以色列、日本、韩国等；欧洲的产量约占世界的28%，是草莓产量第二大洲；北美洲草莓产量约占世界的21%，位居第三5。20 世纪80 年代以来，中国草莓产业蓬勃发展，栽培面积和产量居世界首位，栽培面积已达8 万公顷以上，总产量已达188 万吨以上。中国草莓产量主要集中在河北、山东、辽宁、江苏、安徽、浙江、四川、河南等省6。2010年以来，四川成都双流县年种植冬草莓面积几乎达到稳定，并且都在5 万亩以上，总产量7100 万公斤左右，总产值可高达3.5 亿元以上，因此，草莓种植也成为双流县农民致富的主要项目之一7。2 草莓植物有效成分研究现状据测定草莓果中除含有较丰富的果糖、蔗糖、葡萄糖和各种有酸， 如柠檬酸，苹果酸、水杨酸、氨基酸等以及果胶外，还含有多种矿物质，如钙、磷、铁等。草莓的浆果富含各种维生素，如胡萝卜素、硫胺素、核黄素、烟碱酸等，其中尤以维生素C 的含量最丰富，每百克果肉约含5 01 0 毫克，比苹果，葡萄、西瓜等水果要高出10 倍以上， 就是比维生素C 含量较多的柑桔还要高出2 倍左右。这些成分很多都正用于人们的日常生活中，并且给人们带来健康8。此外，草莓还有较高的药用和医疗价值。据有人研究， 从草莓的浆果、叶、茎、根中可提取出具有抑制肿瘤、改善血液循环、延缓衰老，降血糖、降血脂，增强心血管功能、治疗白血病治疗急、慢性前列腺炎，增强免疫力，调解内分泌，等保健作用的黄酮类和异黄酮类功效物质，它们包括黄烷酮、异黄烷酮、黄酮醇、黄烷酚9,10。 原花青素就属于黄酮类物质，陈红惠，沈清清11等人以草莓中原花青素含量为考察指标，研究提取溶剂浓度、提取温度、料液比、提取时间等因素对原花青素提取效果的影响。通过正交试验，对草莓中原花青素提取工艺进行研究确定草莓果中原花青素的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度70%，料液比1:20，提取温度50 ，提取时间70 min。在最佳提取条件下原花青素的提取率为24.23%11。据此，我们研究草莓茎叶中原花青素提取对草莓作为药用植物或相关功能性保健食品的开发有着一定积极作用。3原花青素概念、活性概述3.1原花青素结构及分布 原花青素（Procyanidins，简称PC）是广泛存在植物界中由黄烷- 3- 醇和黄烷- 3,4- 二醇构成的黄酮类衍生物质11 ，它们不同数量的儿茶素、表儿茶素（黄烷-3-醇或黄烷-3,4-二醇）或没食子酸经C4-C6或C4-C8键缩合而成。最简单的原花青素是儿茶素、表儿茶素或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体，此外还有三聚体、四聚体等直至十聚体。按聚合度的大小，通常将二四聚体称为低聚体(procyanidolic oligomers，简称OPC)，将五聚体以上的称为高(procyanidolic- polymers，简称PPC)。二聚体中，由于两个单体的构象或键合位置的不相同进而形成多种异构体，已分离鉴定的8种结构形式分别命名为B1B8，其中，B1B4是由C4C8键合，B5B8由C4C6键合。在各类原花青素，二聚体分布最广，研究最多是最重要的一类原花青素。三聚体中，也因组成的单体及其相连接碳原子位置的不同形成各种各样的结构并命名C1,C2,C3等12-14。原花青素广泛分布于高等植物的籽、皮、根、茎等多种器官和组织，从以下植物器官组织已成功提取：草莓、葡萄、单子山楂、大麦、豆荚、花生、银杏、白桦树、松树、银杏、日本的罗汉柏、北美的崖柏、土耳其的侧柏、野刺葵、番荔枝、橡树、野草萄、高粱、蚕豆皮、沙棘、莲房、油菜籽、石榴皮苹果、地榆、越桔、茶叶、紫甘薯、洋萎陵菜、大黄等，其中葡萄籽与松树皮提取物中的含量最多15,16。3.2原花青素的理化性质原花青素一般为红棕色粉末，气微、味涩，极性很强，易溶于丙酮、甲醇、乙醇、冰醋酸、正丁醇及乙酸乙酯等极性较大的溶剂，而不溶于苯、四氯化碳及石油醚等极性较小的溶剂。原花青素水溶性也很好，非常荣易被机体吸收，生物利用度高达 90%以上17。然而原花青素稳定性较差，易受外界条件影响，遇光或热并在有氧环境中易氧化缩合，生成分子质量相对较高的PC，且颜色变暗18,19。这类物质中具有多电子的羟基部分，8个酚羟基均与双键共扼，为氢原子的给予体，且芳环上的共扼双键使电子在分子中得到稳定。容易发生亲电取代反应、氧化反应、络合反应、裂解反应以及聚合反应。在酸性条件环境下，若反应时间和反应温度适宜，原花青素类物质会生成红色的花青素，该花青素反应会生成除了生成花青素外的其它未知色素,使得反应后的物质紫外光吸收在450nm附近区域出现肩峰，这被被称为花青素反应。应用该反应原理可以简单便捷地鉴别原花青素物质并测得PC含量，但是不能分析其组分和结构，PC的组分与结构研究一般需与HPLC、MS等方法结合15,20。 3.3原花青素的生物学作用原花青素的结构特点赋予了其许多生物学功能，经多年药理学研究和临床应用发现：PC的抗氧化特性极强，具有清除自由基、抗衰老、抗氧化、抗突变、抗癌、消炎、抗菌、抗病毒等功效。它安全低毒、高效、生物利用率高，在化妆品、保健品、医药及食品添加剂等领域都已有所应用，并且前景十分广阔20。3.3.1 抗氧化抗衰老一般情况下，机体内的自由基存在量和清除量维持动态平衡水平，以保证体内各种自由基的浓度维持在一个对机体有利的生理性水平。然而，当机体内某些因素发生改变或异常，就会有过多自由基积累，这将会加速机体的衰老过程情况甚至还会诱发各种疾病。原花青素是一种较好的氧游离基清除剂和脂质过氧化抑制剂。它可以防止自由基伤害，具有保护细胞的作用。现在大量实验证明原花青素清是目前为止所发现的最强效的抗氧化剂和自由基清除剂，其在体内抗氧化能力是维生素 E 的50 倍、维生素 C 的 20 倍，且近年日来益成为抗氧化清除自由基所瞩目的热点。原花青素特殊的结构使它具有了以下几个方面作用：有效地清除超氧阴离子自由基和羟基等自由基、保护脂质免遭病理性的过氧化损伤、螯合金属离子并在体内形成惰性化合物、帮助机体吸收维生素C、促进细胞内外Ca2+浓度的稳定、减少由于Ca2+异常流动所造成的细胞损伤等，从而达到抵抗机体衰老的作用14,21,22。 郭英等23对葡萄籽提取物的体外抗氧化作用进行了研究，结果表明原花青素可明显降低大鼠脑组织和肝脏中丙二醛的自发性生成，并对 CCl4、H2O2、Fe2+ 、Fe3+等自由基诱发的肝脂质过氧化具有明显的拮抗作用，葡萄籽原花青素能够减慢肝组织还原型谷胱甘肽消耗速率，具有明显的抗氧化作用和清除自由基效应23。 3.3.2抗突变、抗癌变众所周知，由于环境污染造成臭氧层被破坏致使的紫外线照射明显增强、空气中治癌物质增多等等。这些因素都是导致人体组织细胞发生基因突变和癌变的重要原因。近年来，一些与线粒体和细胞核有关的体外实验研究表明，原花青素可抑制癌细胞生长及抵御细胞突变，这也为其用于预防慢性变性性疾病提供了理论基础17,24。段玉清25等就发现莲房富含原花青素，并在此基础上研究了莲房原青素对黑色素瘤 B16 细胞的抑制作用。 结果表明，莲房中提取所得的原花青素明显抑制了B16 细胞生长，抑制程度与原花青素浓度、抑制时间都呈依赖关系。当浓度为25100 mg/L对 B16 细胞抑制作用在72 h 时效果最好，最大抑制率达 84.5%；莲房原花青素还能够有效阻止B16 细胞集落的形成，当莲房原花青素浓度逐渐增大时，其抑制率也明显增高，当莲房原花青素浓度增加为 100 mg/L 时，细胞集落形成抑制率最高为89.9%25。3.3.3抗炎活性炎症发生时，炎性介质组胺、缓解激肽会使的毛细血管通透性增高，原花青素能有效提高血管的抵抗力，改善其通透性，增强毛细血管壁的韧性，使毛细血管的张力和选择透过性减小，保证毛细血管转运物质的能力26。PC是通过控制组织胺、5-羟色胺、前列腺素E2及白三烯等炎症因子的合成和释放，从而有效地抵抗皮肤过敏炎症症状、各种关节炎及胃、十二指肠溃疡及过敏性哮喘症状。原花青素还能够抑制肥大细胞和嗜碱细胞释放大量过敏颗粒，限制透明质酸酶的作用，降低介质脱羧酶的活性，进而对炎症预防达到显著27,28。 3.3.4抗菌、抗病毒在受到细菌、病毒等病原菌侵害害时，植物体内将会诱发黄酮类物质形成，在植物的果实、内种皮、腺体毛等组织细胞内会诱导儿茶素和PC的积累。在许多物种体内沉积的原花青素就是细菌、病毒等病原菌侵染植物的第一道屏障28-29。大麦突变体试验研究表明：原花青素与抵抗镰刀菌有关，这是由于原花青素通过螯合酶（包括微生物的纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶）活性所必须的金属离子形成坚固的晶体屏障，从而抵抗病原体袭击。这也是原花青素含量较高的水果和蔬菜采后感然病菌机率较低的原因所在30。 3.3.5其他生物学活性此外，PC还能够减轻水肿、保护肝脏、改善视力、抗疲劳、抗辐射、抗高血糖、降低血压、调节血脂、对治疗外周静脉功能不全、促进毛发生长、抗心肌缺血再灌注损伤、抗动脉粥样硬化、治疗眼科疾病以及淋巴水肿等疾病 28。近年来， 许多学者对原花青素的生理活性和药用价值进行了深入的研究，取得了丰硕的成果，由此可以看出原花青素的应用范前景十分的广阔。若能对农业生产中含有PC的植物组织进行利用，不仅能让农民获得更高的经济效益还能减少农业生产中的废物排放，促进现代农业环境友好型发展。4 原花青素提取方法由于PC组成和结构的复杂性，其在植物组织中的提取及组分含量的准确表征始终是困扰市场的一个技术难题。目前天然原花青素的提取方法主要包括有机溶剂提取、微波提取、超声波提取以及酶法等，现在就对其进行简单介31。 4.1 有机溶剂提取原花青素能够较好地溶于有机溶剂，在生产应用中我们常用于提取原花青素的有机溶剂有甲醇、丙酮、乙醇和乙酸乙酯，它们的极性大小顺序为乙酸乙酯丙酮乙醇BAD,即：提取次数 乙醇浓度 料液比提取温度；比较各个因素的F比值和 F临界值，其中乙醇浓度和提取次数两个因素的F比 F临界值,因此这两个因素对原花青素的提取具有影响显著；通过各实验组的提取率的比较，最佳条件是A1B1C2D1，即料液比1:15、乙醇浓度20%、提取次数为3次、提取温度30。但综合考虑乙醇浓度和提取次数对原花青素提取率影响显著，结合单因素实验结果选择乙醇浓度为40%时提取率最大，因此本实验最终选择A1B2C2D1，即提取工艺参数为提取温度30、乙醇浓度40%、提取次数为3次、料液比为1:15。在该条件下重复实验3次后测定原花青素含量为3.88%、3.82%、3.85%， RSD值为0.779%，验证了正交优化条件的可靠性。表9 L8(27)正交试验结果分析Tab.9 Analysis of results of orthogonal test L8(27)实验编号ABA*BCA*C误差D原花青素含量(%)实验111111112.051实验211112223.162实验311221123.031实验411222213.484实验522121213.082实验622122123.152实验722211223.281实验822212113.363偏差平方和8.21014.7040.50914.8232.7420.0894.050F比92.247165.2136.697166.55130.80945.506F临界值161.00161.00161.00161.00161.00161.00161.00显著性*均值114.65514.31315.39614.30715.08315.56314.957均值216.68117.02415.94117.03016.25415.77416.380极差2.0262.7110.5452.7231.7710.2111.4234 讨论本实验以草莓茎叶为原材料，采用超声辅助法，从料液比、乙醇浓度、提取温度、超声时间、提取次数等五个方面进行比较，在这些单因素试验的基础上，采用正交优化试验，对提取工艺进行了优化，实验结果表明影响原花青素提取率的因素是: 提取次数 乙醇浓度 料液比温度提取时间；最佳超声波提取法提取条件为:乙醇浓度40%、提取时间15min、提取温度30、料液比1:15、提取次数3次；在该条件下原花青素平均提取含量为3.85%。由文献可知草莓果实中的原花青素含量为1.93%39，远低于草莓茎叶中的原花青素含量，同时与其他文献比较可知，草莓茎叶的原花青素含量也高于松树皮42,43、生粉叶爬山虎种子果梗部位44 等材料，由此看出草莓茎叶可以作为一种新的的原花青素生产原料。本论文通过优化所得原花青素的提取工艺方法简单、操作性强，另外至今还未见对草莓茎叶利用的相关报道，该方法为今后草莓茎叶中原花青素的开发和利用奠定基础，对草莓的综合利用与开发提供了科学的理论依据。参考文献1秦国新,何桥梁,国鲁,雷家军,郭启高. 草莓属植物 SCoT 分析体系的建立及优化J. 果树学报, 2012,29(3): 393397.2雷家军,代汉萍,谭昌华,邓明琴,赵密珍,钱亚明. 中国草莓属(Fragaria)植物的分类研究J. 园艺学报, 2006,33 (1): 15.3Miller O,Kiplinger DC.Interaction of temperature and time of on northwest easter lilies. 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