脂质和脂蛋白代谢紊乱的生物化学检验.ppt

脂蛋白和脂质测定方法学评价 血浆脂蛋白和脂质测定是临床生化检验的常规测定项目。 临床意义 早期发现与诊断高脂蛋白血症 协助诊断动脉粥样硬化症 评价动脉粥样硬化疾患如冠心病和脑梗死等 的危险度 监测评价饮食与药物治疗效果,血脂、脂蛋白及载脂蛋白测定,目前临床上开展的血脂测定项目包括TC、TG、HDL及其亚类胆固醇、LDL-C、Lp（a）以及部分载脂蛋白如ApoAI、ApoB等。其中TC、TG、HDL-C、LDL-C测定是血脂测定的四个基本指标。血浆4冰箱中过夜观察其分层现象及清澈度可初步估计各种脂蛋白的变化状况。血浆脂蛋白电泳结合TC、TG水平有助于高脂血症分型。,概况：,血脂测定标准化：,血脂分析前变异来源于： 生物因素，如年龄、性别、种族等因素的个体差异。 生活方式，包括饮食习惯、吸烟、运动及应激等。 临床方面包括疾病或药物引起的脂代谢改变。 血标本采集与处理方面,准确测定应从分析前的准备开始，包括受试者的准备，标本 采集，合格的试剂、校准物的选用，检测方法选择。,方法学上应该采用美国疾病控制中心（CDC）或中华医学会检验分会推荐的操作方法。,受试者的准备,采血前2周保持平时的饮食习惯 采血前24小时内不饮酒、不做剧烈运动 嗜烟者(每日超过20支)血清中总胆固醇及甘油三酯水平升高；长期大量饮酒会使血脂升高。 禁食12小时以上 妊娠后期各项血脂都会增高 注意有无应用影响血脂的药物，如降血脂药、避孕药等。 除非是卧床病人，一般在采血时取坐位。体位影响水分在血管内外的分布，会影响测试项目的浓度。 在采血前至少应静坐5分钟，一般从肘静脉取血，使用止血带的时间不超过1分钟，穿刺成功后立即松开止血带。,检测范围 血浆脂质测定（TC TG) 血浆脂蛋白测定(HDL-C LDL-C) 载脂蛋白测定(ApoA ApoB) 血浆脂代谢相关蛋白与酶的测定 脂质相关蛋白基因突变分析,一、血浆脂质测定 （一）总胆固醇测定（化学抽提法、酶法） 1、化学法： 抽提皂化洋地黄皂苷沉淀纯化显色比色 干扰因素多，准确测定有赖于从标本中抽提、皂化、纯化过程，因而操作较繁，不适于分析大批量标本，且不适于自动分析。,2、酶法：胆固醇氧化酶- 过氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法 (CHOD-PAP法） 第一反应：生成游离型胆固醇 胆固醇酯+H2O 胆固醇脂酶CHE 游离胆固醇游离脂肪酸 第二反应：用胆固醇氧化酶(CHOD)和过氧化物酶(POD)作用，诱导生成 醌色素，通过吸光度变化定量测定胆固醇。 游离胆固醇2 CHOD 4胆甾烯酮H2O2 2H2O24氨基安替比林酚 POD 醌亚胺 醌亚胺的最大吸收峰在500nm，吸光度与标本中的胆固醇含量成正比。,胆固醇酶测定法的试剂中，除了上述三种酶、酚和4-氨基安替比林外，还有维持pH恒定的缓冲液、胆酸钠、表面活性剂以及稳定剂等。胆酸钠是为了提高胆固醇酯酶的活性，表面活性剂的作用是促进胆固醇从脂蛋白中释放出来。 酶法是常规应用方法，快速准确，标本用量少，便于自动生化分析仪作批量测定。,评价：,主要缺点是：,优点：本法灵敏度高、准确度高、精密度好，线性范围宽。,某些胆固醇酯酶对胆固醇酯的水解不完全，不能用纯胆固醇结晶以有机 溶剂配制的溶液作为TC分析的校准液，而应以准确定值的血清作为标准， 此校准液（品）相当于三级标准。,表面活性剂，如吐温-40可以干扰胆固醇酯酶的作用，而聚乙烯醇6000 可使结果提高12；,本法具有氧化酶反应途径的共同缺陷，易受到一些还原性物质如尿酸、胆红素、维生素C和谷胱甘肽等的干扰。,【参考值】,血清总胆固醇合适范围： 5.20mmol/L ， 边缘升高：5.205.66mmol/L， 升高：5.70mmol/L 。,影响TC水平的因素,年龄与性别； 长期的高胆固醇、高饱和脂肪酸和高热量饮食可使TC增高； 遗传因素； 其它：如缺少运动、脑力劳动、精神紧张等可能使TC升高。,TC除了作为高胆固醇血症的诊断指标之外，不能作为其它任何疾病的诊断指标，对于动脉粥样硬化和冠心病而言，TC是一个明确的危险因子，与冠心病的发病率呈正相关。,【临床意义】,高TC血症：原发和继发,低TC血症：原发和继发,（二）甘油三酯（TG）测定 物理法 化学法 酶法：常用，操作简便、快速准确 甘油激酶法（GK） 甘油氧化酶法（GOD),甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法（GPO-PAP 法）,方法学评价,优点：试剂比较稳定，灵敏度高，线性范围比较宽 缺点：胆红素和维生素C浓度过高可使测定结果偏低。,血清甘油三酯一般随年龄增加而升高，体重超过标准者往往偏高。 合适范围：1.70mmol/L(150mg/dl)， 升高：1.70mmol/L (150mg/dl)。,【参考值】,【临床意义】,原发性高TG血症多有遗传因素，包括家族性高TG血症与家族性型高脂（蛋白）血症等。继发性高TG血症见于糖尿病、糖原累积病、甲状腺机能减退、肾病综合征、妊娠、口服避孕药、酗酒等。大量前瞻性的研究证实，富含TG的脂蛋白是CHD的独立的危险因子，TG增加表明患者存在代谢综合症，需进行治疗。甘油三酯降低比较少见，甲状腺功能亢进、肾上腺皮质功能减退和肝功能严重损伤时可以见到甘油三酯降低,磷脂测定： 利用磷脂酶（D）水解磷脂，测定产物，对其定量。 游离脂肪酸测定：油酸、棕榈酸、硬脂酸 非酶法测定：高效液相层析、比色、滴定、原子吸收 酶法测定：脂肪酶，测定产物乙酰CoA、AMP、 CoA， 进行定量。,二、血浆脂蛋白测定 超速离心分离纯化法 电泳分离法 血浆静置实验 血浆脂蛋白胆固醇测定 HDL-C、LDL-C、Lp(a),血浆脂蛋白胆固醇测定 脂蛋白既有蛋白质又有胆固醇及磷脂，但胆固醇含量较为稳定，因此目前以测定脂蛋白中的胆固醇总量的方法作为脂蛋白的定量依据。 HDL-C LDL-C Lp(a)-C,HDL-C测定 超速离心-化学沉淀法或酶法测定（参考方法） 以前临床上推荐用大分子多聚阴离子和两价阳离子沉淀血清中含ApoB（LDL和VLDL），然后用酶法测上清中的HDL-C。 磷钨酸镁作沉淀剂是推荐常规方法。,近年来，采用直接测定法（均相法），根据脂蛋白与表面活性剂亲合性差异测定，免去了标本预处理（沉淀）步骤，便于自动化，快速简便。,HDL-C 匀相测定法 测定原理,第一反应HDL以外的LDL，CM，VLDL通过葡聚糖硫酸和镁盐凝结。表面活性剂与LDL，VLDL，CM表面的疏水基团有高度亲和力，吸附在这些脂蛋白表面形成掩蔽层，但不发生沉淀，能抑制这类脂蛋白中的胆固醇与酶试剂起反应。 胆固醇酯酶 HDL ( CE ) HDL ( FC ) +游离脂肪酸 胆固醇氧化酶 HDL ( FC )O2+H+ 胆甾烯酮H2O2 POD 2H2O24氨基安替比林酚 醌亚胺,HDL-C合适范围： 1.03mmol/L ,0.90mmol/L 。,【参考值】,【临床意义】,流行病学与临床研究证明，HDL-C与冠心病发病呈负相关，HDL-C低于0.9 mmol/L 是冠心病危险因素。HDL-C大于1.55mmol/L被认为是冠心病的“负”危险因素。 HDL-C下降还多见于脑血管病、糖尿病、肝炎、肝硬化病人。高TG血症往往伴以低HDL-C，肥胖者的HDL-C也多偏低。吸烟可使HDL-C下降，适量饮酒、长期体力劳动和运动会使HDL-C升高。,C 测定 LDL升高是发生发展的主要危险因素。,LDL-C 匀相测定法 测定原理,第一反应： 表面活性剂 、 CM,VLDL,HDL 微粒化胆固醇 H2O2 POD H2O2+4氨基安替比林 无色 表面活性剂 ,LDL-C 测定原理,第二反应: 胆固醇酯酶 LDL (CE)H2O 胆固醇游离脂肪酸 界面活性剂 胆固醇氧化酶 胆固醇O2+H+ 胆甾烯酮H2O2 POD 2H2O2+4AA+HSDA+H3+O 青紫色苯醌色素5 H2O 波长：585nm (4-AA:4氨基安替比林),本测定法在采用胆固醇酯酶及胆固醇过氧化物酶的胆固醇测定体系中，使用仅选择性使LDL溶解的界面活性剂，将LDL中含有的酯型胆固醇及游离型胆固醇诱导到胆固醇反应体系中，测定LDL-胆固醇。 除LDL之外的脂蛋白（HDL、VLDL乳糜微粒）的酶反应受该界面活性剂及糖化合物的阻止，因此这些脂蛋白不会诱导到胆固醇反应体系中发生反应，而在反应液中以脂蛋白形式残存。根据这一原理可以仅仅直接测定血液中LDL-胆固醇。,LDL-C合适范围：3.10mmol/L 边缘升高：3.133.60mmol/L 升高：3.62mmol/L 。,【参考值】,【临床意义】,LDL-C增高是动脉粥样硬化发生发展的主要脂类危险因素。由于TC水平同时也受HDL-C水平的影响，所以最好以LDL-C代替TC作为冠心病危险因素指标。美国国家胆固醇教育计划成人治疗专业组规定以LDL-C水平作高脂蛋白血症的治疗决策及其需要达到的治疗目标。,L p(a)测定 透射比浊应用最为广泛，其原理是利用L p(a)的单克隆抗体，采用多点定标（57点），用log-logit多元回归方程进行曲线拟和运算，该法灵敏度高，便于自动化批量检验。,正常人群的Lp(a)水平呈明显的正偏态分布，大多在200mg/L以下，平均数在120180 mg/L，中位数约100mg/L。Lp(a)水平高于医学决定水平（300mg/L），冠心病危险性明显增高。,【参考值】,【临床意义】,血清Lp(a)水平是动脉粥样硬化性疾病的独立危险因素,与动脉粥样硬化成正相关。,载脂蛋白(Apo)测定 免疫比浊法: 透射比浊、散射比浊 载脂蛋白的特异抗体与血清中相应的抗原结合形成抗原抗体免疫复合物,并形成微细颗粒,混悬于溶液介质中,光线通过浑浊介质溶液时,被吸收一部分,吸收的多少与混浊颗粒的量成正比.在抗体量一定的条件下,抗原越多,抗原抗体复合物越多,溶液越浑浊,吸收光越多,以此对抗原定量,这种通过测定光吸收量的方法称为透射比浊法.,Apo A是 HDL的主要结构蛋白，Apo 是 LDL的主要结构蛋白，因此，Apo A 和Apo B可直接反映HDL和LDL含量。冠心病、 肾病综合症和糖尿病等都有ApoA减少和Apo B的升高。临床上将ApoA和Apo比值作为冠心病的危险指标。,【参考值】：,Apo AI：1.001.50g/L，Apo B：0.801.00g/L。,【临床意义】,ApoAI是HDL的主要结构蛋白， ApoB是LDL的主要结构蛋白，因此，ApoAI和ApoB可直接反映HDL和LDL的含量。