微生物综合实验设计方案5.doc

微生物综合实验设计方案第八小组（曹婉仪 蔡楚萍 贝锦涛 张韵红）1、 取样取三个经高压蒸汽灭菌的锥形瓶，于华师校园内湖中取水样。为使取样具有代表性和全面性，分别选取三个取样点，取样点1：湖的东面，取样点2：中间湖边，取样点3：湖的西面，分别编号1.2.3，于水面以下10cm，取水各100mL，盖好瓶塞。器具：三角瓶*3个二、测水体pH值为了大致地确定水体微生物的生长适宜pH，取好水样后，分别用pH计测量三个水样的值，每个水样各测量三次，取平均值。将三个水样混合均匀，得到混合水样，用pH计测量pH三次，取平均值。器具：pH计3、 分离提纯2种微生物1、材料：混合水样2、方法操作名称具体步骤试剂和材料器具（经高压蒸汽灭菌）配置牛肉膏蛋白胨固体培养基400mL1、配置牛肉膏蛋白胨固体培养基400mL，分装于两个三角瓶2、高压蒸汽灭菌灭菌材料：250ml三角瓶*5，培养皿*1616个，分别是：稀释涂布8个，两次划线各4个，试管*11，1ml移液管*53、倒16个平板 4支试管斜面NaCl 2g蛋白胨4g牛肉膏1.2g 400mL水1mol/LNaOH1mol/L HCI(pH77.6)高压蒸汽灭菌锅天平玻璃棒500ml大烧杯*1个250ml三角瓶*2个封口膜*2张绳子*2条培养皿16套试管*4个胶塞/棉塞*4个报纸多张稀释涂布分离微生物1、取0.2ml混合水样进行稀释，设置四个梯度：原液、10、100、1000，分别装于4个试管中，标明稀释度，每种稀释度5ml2、涂布8个平板3、37恒温培养箱中倒置培养24h混合水样蒸馏水空白平板*8个恒温培养箱1ml移液管*5个10ml量筒试管*4个酒精灯酒精棉球涂布器标签纸平板划线分离微生物1、选取稀释涂布平板操作中分离程度较好的两种微生物涂布分离之后，我们针对的对象就是细菌所以，只用一种培养基培养时间也不用变化的的平板菌落，进行平板划线，各划线2个平板2、37恒温培养箱中倒置培养24h涂布分离的平板空白平板*4个恒温培养箱酒精灯酒精棉球接种环标签纸平板划线分离微生物1、两种微生物均选取划线操作效果好的菌落，进行第二次平板划线操作，各划线2个平板2、 37恒温培养箱中倒置培养24h第一次划线分离的不同菌种的平板*2个空白平板*4个恒温培养箱酒精灯酒精棉球接种环标签纸平板菌种接种到试管保藏1、用接种环把菌种接种到试管斜面，每个菌种接种2个斜面2、37恒温培养箱中培养24h3、待菌种在固体斜面培养基上生长丰满后，注明菌类或菌种名、保藏日期、保藏人，然后置于48的冰箱中保存第二次划线分离的不同菌种的平板*2个空白斜面培养基*4个恒温培养箱冰箱酒精灯酒精棉球接种环标签纸四、革兰氏染色觉得可以写成列表的形式这样看起来好像整洁一点哦所以我把它改成了这样子细菌的革兰氏染色1.实验材料1.1材料 第二次划线分离的不同菌种的平板*2个1.2试剂： 无菌水、结晶紫、碘液、95%乙醇、番红1.3器具 载玻片、接种环、酒精灯2.实验方法步骤序号操作名称操作方法1制片涂片：滴1滴无菌水于载玻片，挑取少许菌体与水滴均匀混合干燥：火焰上方略加温固定：用加热法，通过火焰3次2染色结晶紫初染1min，水洗；碘液媒染1min，水洗；95%乙醇脱色2030s，水洗；番红复染1min，水洗3镜检显微镜油镜观察五、观察细菌的形态特征在高倍镜和油镜下观察细菌形态，拍下照片，画图，描述形态特征器具觉得写成“工具”好一点吧：显微镜六、生理生化试验（淀粉水解、糖酵解）（1）淀粉水解实验还是觉得列表的形式好点的操作名称实验方法接种以无菌操作技术，把两个菌种接种到同一个平板上，划成“+”字形，平板的一边接一个种培养在平皿用“培养皿”正规点吧底部做好记号，盖上盖，37恒温培养箱中倒置培养24h检验感觉用“检验”不是很好平皿盖打开，滴加卢卡氏碘液于接种处记录结果有水解圈：淀粉水解实验阳性，用+表示；无水解圈：淀粉水解实验阴性，用-表示(2)糖酵解实验同样的把它也调整成列表格的形式1 实验材料 1.1实验材料 第二次划线分离的不同菌种的平板*2个、空白平白*1个、试管*5个 1.2实验试剂卢卡氏碘液, 葡萄糖发酵培养基试剂蛋白胨0.1g,NaCl 0.25g,K2HPO4 0.01g,水 50ml,溴麝香草酚蓝（1%水溶液） 0.15ml，葡萄糖 0.5g 1.3实验器具 恒温培养箱、酒精灯、酒精棉球、接种环、标签纸2 实验方法 操作名称操作方法配置糖发酵培养基 配置葡萄糖发酵培养基50ml,分装5支试管中，高压蒸汽灭菌接种取葡萄糖发酵培养基试管3支，分别接入两种菌种，用标签纸标明菌类或菌名、发酵培养基名称，第3支不接种，作为对照。接种后，轻摇试管，使混合均匀培养37恒温培养箱中静止培养24h观察记录结果：黄色、有气泡：产酸产 气，用0表示 黄色、无气泡：产酸不产气，用+表示 紫色、无气泡：不产酸不产气，用-表示配置糖发酵培养基：分别称取蛋白胨和NaCl溶于热水中，调pH至7.4，再加入溴麝香草酚蓝（先用少量95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液），加入糖类，分装试管，装量45cm高，并倒放入一德汉氏小管（管口向下，管内充满培养液）。115湿热灭菌20min。灭菌时注意适当延长煮沸时间，尽量把冷空气排尽，以使德汉氏小管内不存在气泡。常用的糖类：如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖等（后两种糖的用量常加大为1.5%）七、配置菌悬液1、实验材料划线分离出来的两种细菌培养皿2、实验方法 用接种环分别把两种细菌接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基，放入恒温箱中37培养24h。八、探究pH对细菌生长的影响1）第一次测量分光光度值(1)材料：上述菌悬液(2)试剂:1mol/L NaOH 或1mol/L HCL调至pH分别为3、4、5、6、7、8、9牛肉膏蛋白胨液体培养基，无菌生理盐水自来水（需要热水溶解牛肉膏）。(3)250ml三角瓶7个，试管7支，配置牛肉膏蛋白胨液体培养基7个，pH计，大烧杯（是否需要校准），恒温摇床。(4)步骤: 操作试剂或用具配置牛肉膏蛋白胨液体培养基NaCl 8g 蛋白胨16g 牛肉膏4.8g无菌生理盐水1600ml 7个250ml三角瓶 试管7支 ，每个三角瓶中倒入200ml液体培养基，其余分装试管（约25ml/支）调pH值1mol/l NaCl或 HCI溶液 pH计包扎培养基并且灭菌高压灭菌锅121摄氏度20min接种（无菌操作）：移液管移取20.5ml菌悬液于不同pH的三角瓶中移液管 吸气球 牛肉膏蛋白胨液体培养基置于37度恒温箱中培养24h恒温摇床测分光光度值分光光度计OD600记录数据并且描绘关系图2）第二次测量分光光度值(1)材料：重新配置的菌悬液(2)试剂:1mol/L NaOH 或1mol/L HCL调至pH分别为6、6.4、6.8、7.2、7.6、8(假设1)中最适pH为7)牛肉膏蛋白胨液体培养基，无菌生理盐水自来水（需要热水溶解牛肉膏）。(3)250ml三角瓶5个，试管5支，配置牛肉膏蛋白胨液体培养基5个，pH计，大烧杯（是否需要校准），恒温摇床。(4)步骤: 操作试剂或用具配置牛肉膏蛋白胨液体培养基NaCl 5.5g 蛋白胨11g 牛肉膏3.3g 无菌生理盐水1100ml 5个250ml三角瓶 试管5支 ，每个三角瓶中倒入200ml液体培养基，其余分装试管（约20ml/支）调pH值1mol/l NaCl或 HCI溶液 pH计包扎培养基并且灭菌高压灭菌锅121摄氏度20min接种（无菌操作）：移液管移取20.5ml菌悬液于不同pH的三角瓶中移液管 吸气球 牛肉膏蛋白胨液体培养基置于37度恒温箱中培养24h恒温摇床测分光光度值分光光度计OD600记录数据并且描绘关系图附：（1） 牛肉膏蛋白胨液体培养基的：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH77.6（2） 淀粉培养基：蛋白胨10g，NaCl 5g，牛肉膏5g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1000ml，琼脂1520g，121摄氏度灭菌20min。（3） 糖发酵培养基：蛋白胨0.2