时间分辨免疫荧光分析课件

时间分辨免疫荧光分析 （Timeresolved fluoroimmunoassay TRFIA）,2008,广州达瑞抗体工程技术有限公司,标记免疫分析,主要内容,TRF发展史、原理、特点、标记物 TRF与现有检验方法的比较 TRF反应模式的选择 TRF标记物的制备纯化 TRF的实验室操作,标记免疫方法,时间分辨免疫荧光,影响免疫学分析灵敏度的因素（一）,抗原-抗体间反应的亲和性影响分析灵敏度的最根本因素。 理论上说，竞争免疫分析的抗体用量越少，分析灵敏度越高；非竞争免疫分析（测量抗体结合位点被占据的部分），抗体用量越多，分析灵敏度越高。 对于竞争免疫分析，反应的亲和性和操作误差为决定分析灵敏度的主要因素。Sensitivity（max）a/k a为操作误差，k为免疫反应平衡常数 由于a一般难以低于1（a0.01）而k一般小于1012 l/mol ,所以竞争免疫分析在理论上最高灵敏度应低于10-14 mol/l,影响免疫学分析灵敏度的因素（二）,信噪比是非竞争免疫分析分析灵敏度的决定因素。（高亲和性抗体、高比活性的标记物，增加Ab量，降低标记抗体的非特异性吸附有利于提高信噪比） 由于竞争分析和非竞争免疫分析不同的原理（分别为测量抗体结合位点的空余部分和被待测物占据的部分），使得后者的潜在灵敏度比前者高24个数量级。 Ab的亲和性是影响免疫分析灵敏度的最根本因素，决定了免疫分析能达到的最高灵敏度，免疫分析其他条件的优化都是为了接近这一个灵敏度。,标记免疫技术的理论检测灵敏度比较,放射免疫 10-10-10-12mol/L 酶联免疫 10-9-10-10 mol/L 化学发光 10-15mol/L 电化学发光 10-17mol/L 时间分辨荧光 10-18mol/L,TRF发展史（一）,1979年，芬兰SOINI和HEMMIA提出了“时间分辨荧光免疫分析”理论， 1983年SOINI和KOJOLA提出以镧系元素标记为示踪螯合物和时间分辨荧光测量相结合，建立一种新的非放射性微量分析技术。 1985年，时间分辨荧光仪和 TSH、T4等多种商用试剂盒陆续问世 1989年，时间分辨荧光分析技术获诺贝尔化学奖提名 2003年，时间分辨荧光分析技术获国家科技进步二等奖,TRF发展史（二）,90年代以来，时间分辨荧光分析技术因其灵敏度高，操作简便，标准曲线范围宽，不受样品自然荧光干扰，无放射性污染等特点，其方法学研究和临床应用的发展十分迅速。已广泛运用它来进行蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针和生物活性细胞的定量分析。时间分辨荧光分析技术正在成为现代临床微量检验、分子生物学、细胞学和生物化学等生物医学研究中最有发展前景的分析手段。,TRF发展史（三）,国内正在致力于将时间分辨荧光分析用试剂盒甚至仪器国产化，虽然因有些关键技术问题未得解决，质量与国外产品有一定差距，但正在国外厂家的帮助下得以改善 理论研究领域，北京的301医院和江苏原子能研究所是最早进行TRF的临床应用研究。近年来，许多研究机构和医院都在TRF的技术和临床应用方面均做了大量工作。国内TRF的临床应用已开始从研究阶段进入大量使用阶段,时间分辨免疫荧光分析标记物,TRF标记物：镧系元素及其螯合物： 镧系元素共有15种，有四种用于TRF Eu铕、Sm钐、Tb锝、Dy镝 单标记中Eu最为常用 双标记中Eu和Sm最常用,镧系元素特性,铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝（Tb） 镧系元素荧光特点： 荧光寿命极长 镧系元素螯合物（60-900 us) 普通荧光免疫中荧光团：1-100us 样本中蛋白质荧光：1-10us，易猝灭。 同时由于衰变时间长，Eu3+ 标记物在测量时间里可以反复被激发，使得TRF的荧光标记物相对比活性很高,STOKES位移,Stokes位移大（大约290nm） 铕：发射光613nm、激发光340nm， 荧光素的Stokes位移为280nm 荧光特异性强。（发射光谱带很窄：613 5nm） 解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍,时间分辨免疫荧光分析,技术原理: TRF利用了具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物为示踪物,代替荧光物质、酶、同位素、化学发光物质，标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，待反应体系（如：抗原抗体反应、核酸探针杂交、生物素亲和素反应以及靶细胞对效应细胞的杀伤反应等）发生后，用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定反应产物中的荧光强度。根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析。,时间延迟,利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时间段检测特异性荧光，而在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为0。,波长分辨,发射光谱与激发光谱间存在的巨大Stokes位移。可以通过干涉滤光片将发射光谱与激发光谱完全分离,TRFIA的特点,零本底 灵敏度高 操作简便 示踪物稳定 标准曲线范围宽 不受样品自然荧光干扰 操作可实现全自动化 无放射性污染 多标记（双标记）,时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)与放射免疫分析法(RIA)比较,时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）与化学发光分析法（CLIA）比较,TRF技术为临床检测带来的先进性,TRFIA的反应模式,反应模式,固相双位点夹心法和竞争法 ： 夹心法多用于蛋白质类大分子化合物的测定 竞争法多用于小分子半抗原的检测。,双抗体夹心示意图,双抗原夹心法示意图,中和抑制法示意图,固相抗原竞争法(检测抗体),抗原包被、封闭加入一抗/检测样品加入Eu3+标记的二抗加入增强液检测。 检测血清中的乙肝核心抗体,通用固相包被的竞争法,生物素（BAS）系统引入TRF,主要是抗原抗体的生物素化 Eu3+链亲和素（Eu3+SA）作为示踪物待反应体系完成后进行时间分辨荧光检测,SA稳定性好，有较强的耐热性，在免疫测定中的非特异性结合又低，是很好的Eu3标记物前体。,TRFIA系统,80年代至今，TRFIA已有四种系统 DELFIA系统 FIAgen系统 TBP系统 EALL系统,DELFIA系统,即通常所说的解离增强镧系元素荧光免疫分析（Dissociation Enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay），以聚氨基多羧酸类为螯合剂，反应后需用酸性增强液将Eu3+解离下来，此系统灵敏度高，是最经典的检测系统。,FIAgen系统,该系统是由加拿大Cyber flour公司推出的以4，7双（氯磺苯基）1，10二氮杂菲2，9二羧酸（BCPDA）为螯合剂，连接Eu3+和蛋白质，可实现固相测量，从而避免了外源性的Eu3+的污染。,TBP系统,TBP系统是以三联吡啶类穴状化合物（tribipyridincryptate, TBP）将Eu3+连接到蛋白质上，可以直接测量固相和均相荧光。,EALL系统,EALL系统是酶放大时间分辨荧光检测系统，该系统结合了稀土荧光和酶的放大作用，以碱性磷酸酶（ALP）为标记物，水解后生成的5氟水杨酸（5FSA）在碱性条件下与Tb3+EDTA形成强荧光络合物，从而进行荧光的测定。,螯合物的研究（一）,为何使用螯合物： 稀土元素作为金属离子，很难直接与抗原抗体结合，因此在标记时需要有一种双功能基团的螯合物，一端与稀土离子连接，一端与抗原抗体的自由氨基连接。,螯合物的研究（二）,1. 多氨基多羧基酸螯和物 N（P异硫氢基苄基）DDTA 氨基苯基EDTA 二乙烯三氨五乙酸酐(DTPA) 异硫氢酸苯基EDTA 异硫氢酸苯甲基DATT 氨基苯基四氮杂环十二烷四乙酸 1(P苯双氮)EDTA FIAgen系统的BCPDA 特点：分子内带有相应的基团，可以和镧系元素相连构成螯和物，此螯和物和元素的螯和能力强，标记共轭物的比活度较高。,螯合物的研究（三）,2. 芳香类的螯和物： BCPDA、水杨酸、苯甲酸及其衍生物 特点： 具有共轭体系，有很强的光吸收性质，常可发出强烈荧光。,3. 二酮体类螯和物: (-萘酰三氟丙酮)-NTA、笨甲酰三氟丙酮（BTA），TTA，PTA， -NTA是增强液的成分。,4. 特殊功能螯和物：W1174和W2014 W1174：小分子半抗原的铕标记 W2014：Eu W2014非常稳定，可用于核酸的杂交过程。,多标记技术,多标记的实现,与其他镧系元素螯和物相比，Eu螯和物更容易获得较高的荧光量子产率与较低的荧光本底，所以Eu在TRF中应用最广。,多标记的原理,不同镧系离子间的荧光波长和荧光衰变时间 引入了两种或两种以上的镧系离子标记物 通过时间分辨荧光仪测量 同时检测样品中的多种物质,目前的多标记技术（一）,常用的镧系离子有两对： Eu3+和Sm3+ Eu3+和Tb3+ 共用荧光增强液（CFES）的使用，使得两种以上的标记成为可能,目前的多标记项目,AFP和HCG PSA（游离和总PSA）,TRF中的解离增强技术,增强液原理,增强液是提高检测灵敏度的一个关键因素（酸性条件） 以DELFIA系统为例，加入增强液后，可以使Eu3+从反应复合物中解离下来，游离的Eu3+同增强液中的另一种螯合剂形成一种胶态分子团，这种分子团在激发光的激发下能够发出强烈荧光，信号可以增强100万倍。,增强液主要成分及作用,萘甲酰三氟丙酮（NTA）：作用是使Eu3+解离并增强新形成络合物的荧光强度。 TOPO(三辛基氧化膦)：作用是协同配位，增强络合物的荧光。 Triton X-100：作用是在新的络合物外形成微囊，保护其能量不散失。 醋酸：作用是提供酸性环境，便于Eu3+的解离。 亚沸三蒸水,TRF的应用（一）,内分泌科检查： 甲状腺系列：T3、T4、FT3、FT4、TSH、TBG、TG、TGAb、TPoAb 糖尿病系列：insulin、C-Peptide 生长激素：Hgh 其他：皮质醇Cortisol 细胞学检查： 细胞受体检测（包括MHC，HLA等9种检测项目） 肿瘤科检查： AFP、CEA、CA-50、PSA、hTg、2-micro、NSEPAP、CA-242、PSA(total/free)、PSA EQM、CA-199、CA-125、CA153、CA-724,TRF的应用（二）,传染病检查： 乙肝系列：HBsAg、HBsAb、HbeAg、HBeAb、HbcAb 其他：HCV、HIV 妇产科检查： FSH、LH、hCG、Prolactin、E3、E2、Testosterone、Progesterone、 血液科检查： 贫血检查：（Ferritin、VitB12、叶酸） 白血病分型、免疫细胞分型、细胞毒实验等40多种检测项目。 遗传科检查： 产前筛查：hAFP/Free Hcg 新生儿筛查：Neo. hTSH、Neo.T4、Neo.17-OH-Prog 科研工具： 核酸探针及基因杂交检测：多标记定量PCR检测 单标记检测，双标记检测，四标记检测等 包括过敏原、细胞因子、传染病药物、检测等范围的一千余种项目。,抗体的铕标记与纯化,理想标记物的条件,标记物具备良好的可检测性 标记物在样品或分析环境中不存在或存在量不影响免疫分析 标记方法简单、标记条件温和 标记物具有较小的体积，良好的水溶性和理化性状的稳定性 标记物无毒、无害，不对人和环境造成不良影响 标记物信号与标记物浓度能在很宽浓度范围内呈线性关系 对固相和蛋白质无非特异性结合 目前，还没有完全满足以上条件的标记物。,铕标记物的特点,易于操作 温和的反应条件 标记物对蛋白的影响小 高标记效率 标记物稳定 较长的货价期 标记物安全无放射性 实现了原子标记,原子标记的优点,标记点较多，检测更灵敏 对蛋白质活性影响小 用生物素，酶等大分子标记，需通过一系列化学反应来检测，影响因素多。原子直接标记，避免了不利因素的影响 不影响被标记物空间结构，保证其稳定性 原子标记，能更准确地定量检测DNA、RNA,影响标记的条件,缓冲体系 标记的PH值 标记温度 标记时间 标记物和蛋白的摩尔比值,标记个数（比活性）,分子量 期望标记个数 160kD，McAB 610 160kD，Poly AB 26 100 000 47 50 000 14 30 000 13,但一般标记个数不大于20个,标记步骤,预处理（要求蛋白浓度 1mg/ml） 蛋白标记（4或室温） 标记蛋白的纯化（分子筛）,填料的选择,分子量 填料 100 000 Superdex 200 或 Sephadex G-50 30-100 000 Superdex 75 或 Sephadex G-50 15-30 000 Sephadex G-50 2500- 15 000 Sephadex G-25 2500 RP-HPLC,纯化示意图,纯化后工艺的摸索,峰管的确定 包被量的选择 包被体系的确定 铕标记物工作稀释度摸索 抗体的冻干保存,抗体纯化定量配制质检,标准抗原配制质检,增强液配制质检,抗体标记、纯化质检,质控参照品抽样质检分装,阴性质控参照品抽样质检分装,试剂盒组装成成品-20冰箱保存1%抽样质检,TRFIA试剂盒生产流程,达瑞的TRF进展情况,试剂盒的研制（新药的 报批） 仪器的研制（软硬件的开发） 配套试剂（ES，洗液）,达瑞试剂盒产品,乙肝两对半 AFP、CEA、CA125、 CA19-9、NSE、CA50、总PSA、 胰岛素、C肽、HCG、LH、FSH、PRL、FER,试剂盒性能的指标,灵敏度 特异性 稳定性（37摄氏度条件下的破坏实验） 精密度（CV） 测量的线性范围,HBsAg（双抗体夹心法）TRF试剂盒性能比较,HBsAb（双抗原夹心法）TRF试剂盒性能比较,HBeAg（双抗体夹心法）TRF试剂盒性能比较,HBeAb（双抗体夹心竞争抑制法 ）TRF试剂盒性能比较,HBc TRF试剂盒性能比较,AFP（双抗体夹心法）TRF试剂盒性能比较,CEA（双抗体夹心法）TRF试剂盒性能比较,NSE（双抗体夹心法）TRF试剂盒性能比较,胰岛素（双抗体夹心法）TRF试剂盒性能比较,C肽（双抗体夹心法）TRF试剂盒性能比较,CA125 TRF试剂盒与化学发光试剂盒性能比较,CA19-9 TRF试剂盒与化学发光试剂盒性能比较,与Wallc试剂盒相比本公司试剂盒的缺点,本底普遍偏高 灵敏度略低 最高点荧光值偏低,原因： 原料的选择不同 包被及封闭工艺的差距 标记及纯化工艺的不同 抗体亲和性的高低,项目成熟程度,（一）成果的技术鉴定文件或产品性能检测报告,已有AFP、CEA（国家二类新药）两种检测试剂盒已通过中国药品生物制品检定所检定，国家药品监督局已受理。另外，已完成6种医疗器械类试剂（胰岛素、C肽、催乳素、黄体生成素、促卵泡激素和绒毛膜促性腺激素）也已通过中国药品生物制品检定所检定。,（二）产品质量的稳定性，以及在价格、性能等方面被用户认可的情况等。,产品已达到的技术性能指标： 试剂盒灵敏度为0.1ng/ml，对临床样品的检出率大于95%； 试剂盒特异性大于97%； 精密度：分析内小于10%，分析间小于15%； 稳定性：4保存期大于一年，37保存期大于7天； 所测得中国药品生物制品检定所提供的质控血清在范围内。 目前我公司产品已在多家三甲医院免费试用，医院试用后反馈自产试剂盒性能与国外同类产品相当。另外，本技术产品已被国内用户普遍接受。,产品开发研究 AFP、CEA（国家二类新药）两种检测试剂盒已通过中国药品生物制品检定所检定，国家药品监督局已受理。 6种医疗器械类试剂（胰岛素、C肽、催乳素、黄体生成素、促卵泡激素和绒毛膜促性腺激素）也已通过中国药品生物制品检定所检定。 还有20多种产品（包括HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb、SARS、CA50，CA125、CA15-3、CA19-9、tPSA、NSE、cyfra-211、-HCG、T3、T4、TSH、TES、Ferritin、CRP、CK-MB）已经完成实验室研究和部分临床验证，部分产品已批量试生产。 研制了本公司第一代时间分辨荧光免疫分析仪DR-M601。,TRF的实验室操作