技术及诱导多功能干细胞（ips）在医学领域的发展应用ppt课件

SIDANSAI Biotechnology,Innovator on TALEN technology and Stem Cell research,Talen技术及诱导多功能干细胞 在医学领域的发展应用,俞加琳上海斯丹赛生物技术有限公司,靶向基因修饰,经典难题：基因敲除（Knockout） 什么是基因敲除：通过某种方法将一个特定靶基因破坏或失活，使其失去原有的功能。 为什么要做基因敲除：基因敲除是寻找、证明基因功能过程中的必要步骤之一，是基因工程和基因治疗的重要手段。,基因敲除的方法,同源重组 (Homologous Recombination) 依赖DNA分子的互补性，经典基因敲除方法 特点：效率低（1 per 106 cells），实验周期长 RNA干扰 (RNA interference), 反义寡核苷酸(Morpholino) 依赖RNA分子的互补性：高效性，特异性； 特点：临时性，基因沉默而非敲除；,锌指核糖核酸酶（ZFN） DNA 识别域 (ZFP) + 非特异性核酸内切酶构成（FokI),依赖DNA识别域的特异性：效率高 但存在脱靶现象，专利被Sangamo垄断,基因敲除的方法,TALE domain: DNA 识别域 TALE，植物病原体黄单胞菌 Xantomonas 用于调控宿主基因 由34的氨基酸长度的重复单位构成 第12，13位点氨基酸（ repeat-variable di-residue，RVD）不同 RVD决定识别位点不同 Nuclease domain: DNA剪切域 FokI，发现于海床黄杆菌 Flavobacterium okeanokoites 采取其非特异性DNA剪切结构域 形成二聚体时发生剪切,N,C,TALE,FokI,LTPDAVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHG,NI A HD C NG T NN G,A T T C T G C T A A C T C A T A C,新的里程碑技术： TALEN (transcription activator-like effector nuclease),TALEN切割双链,5,5,3,3,左臂,右臂,FokI 聚合,DSB Double strand Break,Non-homologous End Joining (NHEJ),Homologous Recombination (HR),无模板,有模板,Gene Disruption,Gene insertion,Gene replacement,应用 II：基因敲入,Nature Biotechnology 29， 731-734 （2011）,TALEN 的实际应用,应用 III: 点突变,TALEN 的实际应用,TALEN广泛应用,Biotechnol Bioeng. 2013 Mar 18. doi: 10.1002/bit.24890,拟南芥,短兵草,牛,蟋蟀,果蝇,仓鼠,人,青鳉,小鼠,线虫,大鼠,水稻,蚕,烟草,酵母,斑马鱼,青蛙,猪,构建TALEN质粒,如何将这些高度重复的 DNA片段连接起来？,TALEN的组装(Golden Gate),PCR 3步,Digest 2步,Ligate 2步,斯丹赛一步法,只要4-5小时，这些片段就全部连接起来了,一步连接,1,2,3,6,5,4,9,13,7,10,12,16,8,14,11,15,17,18,So EASY！ SO FAST！,FastTALETM连接TALEN,N,C,N,C,TALEN modules at 9 positions,TALEN backbone vectors,TALEN assembled vectors,Promoter,FokI,Promoter,FokI,x4,x16,x4,x16,x4,x16,x4,x16,x4,x16,x4,x16,x16,x16,x4,x16,Position 1,Position 2,Position 3,Position 4,Position 5,Position 6,Position 7,Position 8,Position 9,1/2,9 x 16 dimers, 7 x 4 monomers Complete library: 172,CMV, EF1a, Ubi, 35S, T7, SP6,Maximum RVDs: 18.5 Minimum RVDs: 11.5,多种TALEN骨架载体，满足不同物种需求,第一组载体：干细胞专用打靶载体，采用EF1启动子。 第二组载体：构建动物模型专用载体，含有原核表达启动子sp6或T7，便于体外转录。 第三组载体：普通细胞打靶载体，采用CMV启动子。 第四组载体：植物专用打靶载体，采用ubiqutin或35s启动子。,TALEN质粒构建流程,靶点设计,挑克隆 细菌培养,DNA质粒抽提 酶切鉴定,得到测序 正确质粒,TALEN连接,细菌转化,质粒测序鉴定,Day 1,Day 2,Day 3,Day 4,4天得到构建正确的TALEN质粒！ 简单、快速！,靶点设计,Decide TALEN target (left arm/right arm) TALE-NT2.0 / DNASTAR / Target: 12-19bp Spacer: 12-21bp 5 end 0 position: must be T 为了得到高活性质粒，建议设计2X3组合。,TALEN连接,1.设计序列， 选择模块,2.加样， 进行连接,4-5h完成,转化至感受态细胞 在Kana+ LB平板中培养,细菌转化,挑单克隆， 细菌培养,挑 5-12 个克隆（连接效率50%） Kana+ LB培养液,单克隆菌落,将单菌落接入含5ml Ka+的LB培养液的试管中,DNA质粒抽提，酶切鉴定,DNA质粒小抽提 使用BamHI+PstI双酶切，植物载体采用BamHI+SpeI,target: 16 nt,target: 19 nt,左臂,右臂,1kb Marker,1 kb Marker,Digestion,Digestion,Asssembly length: 15x102=1530,Asssembly length: 18x102=1836,On backbone: 531,Total length: 1530+531=2061,On backbone: 531,Total length: 1836+531=2367,1个单模块（由34个氨基酸，即102个碱基组成）识别一个碱基,上游引物305: 5-CTCCCCTTCAGCTGGACAC-3 下游引物306: 5-AGCTGGGCCACGATTGAC-3 S247引物： 5- GGGAGCACCCCTCAACCTGAC-3,质粒测序,测序结果比对,标准序列,测序结果,得到测序正确质粒,305,306,测序正确质粒,转 染,Mix cell,抽提基因组、PCR测序并进行TA克隆,打靶效率,细胞单克隆,获得稳定敲除细胞系,药筛,应用实例1 细胞建系,Hela细胞中XX基因敲除的稳转系建立： 项目执行时长2个月,设计TALEN识别序列； 构建TALEN载体； 测序验证质粒正确性,实验流程：,序列100%正确,脂质体转染入Hela细胞中；puromycin药物筛选3天,收集筛选后剩余的部分细胞，抽提基因组DNA, 进行PCR,PCR产物送测序,比对测序结果，初步确认TALEN活性,续上,大于53%（每100个细胞中有53个细胞发生碱基突变）,PCR产物TA克隆、单克隆测序确定打靶效率,续上,2019/5/14,最终挑选出阳性单细胞克隆，扩增，保存，稳定遗传系建立成功,消化细胞呈单细胞，接种于96孔板中，待单细胞克隆长大后，同上进行鉴定,部分单细胞克隆测序结果：,单克隆鉴定结果表明：基因改变类型包括插入和缺失两种形式，造成基因移码突变，成功构建稳转系。,根据打靶效率，挑取一定数量单克隆进行测序。,续上,根据测序峰图，鉴定出双拷贝敲除的单克隆,打靶效率经验参考,建立knock-out细胞系（双拷贝敲除）： 293T，hela细胞：建系成功率100%，目前成功建系19个，打靶效率约为30 % -70%，最短耗时2个月 ES/iPS细胞：建系成功率100%，目前成功建系7个，打靶效率约为20 % -50%，最短耗时4个月,数据统计至2013.07月,打靶效率经验参考,建立knock-in细胞系（单拷贝敲入） ： 293T、hela细胞等：建系成功率100%，目前已成功建系6个，打靶效率约为20 % -55%，最短耗时3个月 ES/iPS细胞：建系成功率100%，目前已成功建系2个，最短耗时5.5个月，打靶效率约为10 % -28%,数据统计至2013.07月,应用实例2 动物模型斑马鱼,Zebrafish-gene A,WT,TALEN,580bp,Zebrafish-geneA (Kpn I),WT,TALEN,580bp,401bp,179bp,Genomic PCR,Restrictive enzyme digest,斑马鱼内XX基因敲除,结果反馈,我方设计TALEN识别序列； 提供最终的TALEN质粒,TALEN质粒线性化； 体外转录,显微注射一细胞期受精卵,48h后收集，抽提10-15个胚胎的基因组DNA，混合,PCR扩增，酶切看结果,打靶效率为80%以上,应用实例3 动物模型小鼠,设计构建TALEN打靶载体 细胞水平TALEN活性检测 体外转录生成mRNA 往受精卵注射mRNA 嵌合体小鼠（F0） F1 heterozygote F2 homozygote,应用实例3 动物模型小鼠,leptinR Founders identification by T7E1 mismatch sensitive assays,sequences of TALEN-induced mutations in leptinR locus in different strains,应用实例3 动物模型小鼠,Leptin Receptor TALENed F0 founder,WT littermate,C57BL6 strain,FVB strain,Leptin Receptor TALENed F0 founder,WT littermate,斯丹赛部分成功案例,北京大学 张老师成功建立人ES细胞某基因敲除系 北京大学 尹老师成功建立人结肠癌细胞某基因敲除系 长征医院 周老师成功建立乳腺癌细胞某基因敲入细胞系 清华大学 罗老师成功建立小鼠ES细胞某基因敲入系 中国科学院生物物理研究所 范老师成功建立小鼠MEF细胞某基因敲除系 中国科学院上海生化所 宋老师利用培训班拿到的平板直接建立仓鼠细胞某基因敲除系；,细胞建系成功案例,斯丹赛部分成功案例,华东师范大学 王老师成功得到某基因敲除小鼠模型，打靶效率30% 南京大学 官老师成功得到某基因敲除小鼠模型，打靶效率12.7% 南方模式 费老师成功得到某基因敲除小鼠模型 华东师范大学 李老师成功得到某基因敲除小鼠模型,小鼠建模成功案例,斯丹赛部分成功案例,中国科学院水生生物研究所 肖老师成功得到斑马鱼F1代杂合子，效率为14/16，并且后续得到F2代纯合子 复旦大学 姚老师成功得到斑马鱼某基因敲除的F1代杂合体 中国科学院健康科学研究所 荆老师成功的得到了斑马鱼突变体，打靶效率达20%； 华中科技大学 刘老师成功得到斑马鱼某基因敲除的突变体； 湖南师范大学 邓老师成功得到斑马鱼某基因敲除的F1代杂合体F1代中突变体的概率约为30%,斑马鱼建模成功案例,斯丹赛部分成功案例,北京生命科学研究所 王老师成功获得F0突变体果蝇 珠海威康健生物科技有限公司 杨老师成功获得F0突变体果蝇 湖南师范大学 邓老师成功获得F0突变体果蝇,果蝇建模成功案例,TALEN 服务和产品,1.TALEN 试剂盒：15次/30次/60次。 2.TALEN质粒构建服务：1）质粒构建 2）质粒构建及细胞水平活性检测 3.基因Knock-out 或Knock-in细胞建系服务： 1）Knock-out细胞系； 2）Knock-in细胞系； 3）点突变细胞系。 4.基因Knock-out 或Knock-in动物模型 5. TALEN培训班,专业、完善的技术保障,保证客户得到高活性TALEN质粒并且最终建系/建模成功； 拥有强大的技术团体，提供全程免费的技术支持； 协助客户完善TALEN 平台的构建； 若发生建系/建模失败，则全额退款。,培训地点：上海市浦东新区蔡伦路720弄301室 培训时间：9:30-19:00 培训内容： TALEN技术相关讲座：TALEN技术介绍、发展与应用 TALEN构建的实验室操作：根据设计好的TALEN序列 连接TALEN； TALEN技术疑难解答及讨论。,全国TALEN技术培训班,iPS细胞建系及临床应用,Shinya Yamanaka (山中伸弥),John Gurdon(约翰格登),2012年诺贝尔生理 医学奖获得者,研究进展：干细胞是人体内可以转化为各种组织和器官的细胞，过去只能从胚胎中获得。 2006年日本京都大学山中伸弥领导的实验室在世界著名学术杂志细胞上首次报道了诱导多能干细胞（Induced Pluripotent Stem cells，iPS）技术研究。 2007年末，Thompson实验室和山中伸弥实验室几乎同时报道，利用iPS技术同样可以诱导人皮肤纤维母细胞成为几乎与胚胎干细胞完全一样的多能干细胞。 2008年4月，美国加利福尼亚大学科学家报告称，他们将实验鼠皮肤细胞改造成ips细胞，然后成功使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞。 2009年2月，日本东京大学科学家宣布，成功利用人类皮肤细胞制成的ips细胞培育出血小板，而且从技术上说用ips细胞培育人类红细胞和白细胞都是可能的；紧接着，日本庆应大学科学家又宣布，成功用实验鼠的ips细胞培育出鼠角膜上皮细胞。,2009年3月伊始，ips细胞研究便相继迎来两项重大突破。英国和加拿大科学家发现了不借助病毒、安全将普通皮肤细胞转化为ips细胞的方法；美国科学家则在细胞杂志上宣布，他们可以将ips细胞中因转化需要而植入的有害基因移除，且保证神经元细胞的基本功能不受影响。 2009年7月，ips细胞研究在临床应用道路上又迈出非常重要的一步。据英国自然杂志网站23日报道，中国科学家周琪和高绍荣等人利用ips细胞克隆出活体实验鼠，首次证明ips细胞与胚胎干细胞一样具有全能性。该成果让人们看到了ips细胞的实用性。 2010年7月，巴西圣保罗大学医疗系的科研人员最近通过改造皮肤基因获取诱导多功能干细胞（iPS细胞）的科研成果。,Oct4 Sox2 Klf4 C-myc,TALEN 技术,iPS细胞,基因敲除 iPS细胞,定点修复 iPS细胞,定向分化,体外研究：疾病模型建立; 发病过程研究; 疾病机理研究; 药物筛选,体内应用,再生医学,人类iPS 产生流程,用于iPS建立的体细胞来源,皮肤成纤维细胞 骨髓来源的细胞 脂肪干细胞 肠上皮细胞 尿液细胞-无创！ 毛囊间充质干细胞 。,一 切 体 细 胞 皆 有 可 能 ！,iPSCs 临床应用,疾病模型 建立,疾病机理研究,细胞替代 疗法,发病过程研究,药物筛选,帕金森症PD 脊髓性肌萎缩SMA 镰刀形细胞贫血症 -1抗胰蛋白质酶缺陷症 ,iPS细胞系的临床应用,1.疾病模型建立,1. 重编程设计 (Oct4, Sox2, Klf4, Myc),2. 定向分化 （actin A ,维甲酸，活化素A）,Virus, plasmid, protein, mRNA,Co-culture with stroma, Treatment with cytokines,神经元,心肌细胞,肝细胞,胰岛细胞,疾病模型用于发病过程研究,More: 帕金森症PD 脊髓性肌萎缩SMA 早衰症 家族性缺陷自主症FD RETT综合症