蛋白质组学技术课件

Proteomics Proteomics techniques,研究方向：分子免疫学,蛋白质组学技术,一、蛋白质分离技术 二、蛋白质鉴定技术 三、蛋白质相互作用研究,蛋白质组的分离技术,1、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 2D-PAGE 2、双向荧光差异凝胶电泳（ two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE）,双向荧光差异凝胶电泳,2D-DIGE技术最早在1997年由Jon Minden实验室提出，后来Amersham成为此项技术的主要推动者。 技术路线：将样品在电泳前标记Cy2、Cy3 和Cy5 这3 种荧光染料,然后将标记后的3 种样品混合, 同时在一块胶上进行电泳。由于不同的荧光标记样品有不同的激发波长，可通过不同的滤光片得到不同颜色荧光信号,根据这些信号的比例来判断样品之间蛋白质的差异。,Workflow of DIGE,内标：为实验中的每张胶上的每个蛋白质都提供一个参考点。理想情况下，内标中最好含有来源于所有样本的每一个蛋白质。最好的办法就是将所有的样本等量混合来形成内标。,7、First dimension IEF 8、Second dimension SDS-PAGE 9、Gel Imaging 10、DecyderTM 11、Protein identification,蛋白质组的鉴定技术,1、质谱（mass spectrum，MS）鉴定 2、同位素标记亲和标签技术（ Isotope-coded affinity tag ，ICAT）,质谱鉴定,原理： 通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（M/Z值）的蛋白离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。 电离源电场、磁场离子检测器确定离子的M/Z值,同位素标记亲和标签技术（ICAT）,该技术利用具有不同质量的同位素亲和标签( ICAT) 预先选择性地标记含有半胱氨酸的肽类，分离纯化后通过串联质谱进行鉴定，根据质谱图上不同ICAT试剂标记的一对肽段离子的强度比例，定量分析它的母本蛋白质在原来细胞中的相对丰度。,Isotope-coded affinity tag （ICAT）试剂,主要包括三部分： 1、专一的反应基团； 2、中间的连接子，结合稳定的同位素； 3、亲和反应基团，能与生物素结合选择分离ICAT标记的多肽。 试剂分为两种形式,连接子含有 8个氘原子为“ 重型 ” ,含有 8个氢原子为“ 轻型 ” ,这两种形式的 I CAT试剂质量相差 8D。,ICAT试剂结构,同位素标记亲和标签技术（ICAT）,ICAT技术的过程大概分为3个阶段： 1、利用重型和轻型ICAT试剂分别标记两种不同的蛋白样本，标记完全混合后，用胰酶水解成大小不同的肽段 2、使用生物素亲和层析法分离纯化与ICAT试剂反应的肽段； 3、标记的肽段洗脱后经液相色谱再次分离，串联质谱分析峰型一致的一对肽段峰的离子强度，由此既可推断出两种样品中同一种蛋白的相对含量。,蛋白质相互作用的研究,1、酵母双杂交系统 2、噬菌体展示技术,噬菌体展示技术,噬菌体展示技术（Phage Display Techniques，PDT）是将目的基因与编码噬菌体衣壳蛋白基因相连接，并插入到噬菌体表达载体上，使多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，被展示的多肽可保持相对独立的空间结构和生物活性。 将外源蛋白或多肽表达于噬茵体表面，就可根据其性质利用它与其他生物或非生物物质的亲和性对含目的基因的噬菌体进行筛选，并利用这些噬菌体再感染大肠杆菌