人乳头瘤病毒16L1原核表达质粒的构建.doc

人乳头瘤病毒16L1原核表达质粒的构建作者：左凤琼 赵素兰 李婉宜 李晓红 吕梅励 蒋中华 李明远 欧阳运薇【摘要】 目的：构建人乳头瘤病毒16L1的原核表达质粒，为下一步探讨蛋白的表达以及蛋白的功能研究作准备。方法：以临床HPV16阳性标本为模板，PCR扩增L1的片段，L1片段经EcoR和Sal双酶切后,插入载体pGEX4T1，转化JM109感受态细胞，平板筛选获得pGEX4T1/HPV L1的阳性质粒。通过酶切、测序验证质粒的正确性。结果：构建了原核表达质粒pGEX4T1/HPV16L1，并通过酶切、测序等方法验证其完全正确。结论：成功构建的pGEX4T1/HPVL1为今后的蛋白的表达和功能研究打好了坚实的基础，为HPV16的疫苗研究提供了有益的支持。 【关键词】 人乳头瘤病毒16；质粒；构建宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有37万新发病例，有20万妇女死于宫颈癌。近年来，人乳头瘤病毒（human papillomaviruses，HPV）感染被认为与大多数宫颈癌发生和发展密切相关1。据报道，99%以上的宫颈部位肿瘤可检测到HPV DNA的存在。因此,研究HPV疫苗对于宫颈癌的预防和治疗具有重要作用。迄今已发现的乳头瘤病毒多达100多型，其中HPV16与宫颈癌关系最为密切。HPV癌蛋白E5、E6、E7具有刺激生长和转化功能2,3。E5是细胞膜或内膜整合蛋白。在感染细胞克隆早期的繁殖、扩张中起重要作用。HPV的外壳蛋白L1是保护性抗原,具有较强的保守性：在选择压力等外界作用下变异很小。不同型别蛋白氨基酸序列同源性高达60%。本课题选择HPV16的保护性抗原L1所在基因片段为目标，构建原核表达质粒，为获得具有预防宫颈癌作用的蛋白作准备。 1材料 主要仪器有凝胶成像仪购自Media Cybernetics（USA）公司，电泳仪购自BioMad公司。主要试剂：PremixTag,限制性内切酶EcoR和Sal、T4 DNA连接酶为TaKaRa产品,DNA相对分子质量标准(DL2000)为北京天为时代科技有限公司产品,DNA相对分子质量标准DNA/Hind为TaKaRa产品,胶回收使用上海华舜生物公司试剂盒Gel Extraction Min Kit。质粒提取使用Omega公司的E.Z.N.A Plasmid Mininprep Kit。HPV16阳性患者子宫颈细胞来自四川大学华西妇产儿童医院。大肠杆菌JM109购自TaKaRa 公司。pGEX4T1质粒由本室保存。 2方法 2.1HPV16L1基因扩增根据GenBank中查得的东亚型HPV16全基因序列(基因登陆号AF534061)设计扩增HPV16 L1基因的上下游引物。上游引物5GCGGAATTCATGCAGGTGACTTTTATTTACA3，下游引物5GCGGTCGACTAAAAATTTGCGTCCTAAAG3上、下游引物5端分别设有EcoR和Sal酶切位点，所扩增的目的片段长度为1485 bp，引物合成由上海Invitrogen生物工程公司完成。以HPV16阳性子宫颈细胞DNA为模板克隆HPV16 L1基因。PCR扩增条件为94预变性4min，变性9430s,退火5335s,延伸721.5min,最后7210 min后终止反应。 2.2HPV16L1原核表达质粒的构建对PCR产物和pGEX4T1载体分别用EcoR、Sal双酶切和琼脂糖电泳回收目的片段，经T4连接酶16过夜连接HPV16L1和pGEX4T1。连接产物转化感受态细胞JM109，Amp平板筛选阳性克隆。阳性克隆经EcoR、Sal双酶切和PCR鉴定，获得初步正确的克隆。将该克隆送TaKaRa公司测序。 3结果 3.1PCR扩增HPVL1蛋白基因以HPV16阳性子宫颈细胞DNA为模板，用L1基因的特异引物进行PCR反应，PCR产物琼脂糖电泳结果见图1。可见，2000bp与1000bp中间处有一明显条带，大小与预期值相符（1485bp）。 3.2 重组质粒酶切鉴定转化JM109之后，阳性菌落经EcoR或Sal单酶切鉴定显示，产物为约5500bp的单一片段；用EcoRI和Sal双酶切鉴定显示，产物为约5000bp和约1500bp的两个片段。结果表明，重组质粒单酶切的片段大小与理论值相符（5454），双酶切后的大片段为载体片段，小片段为插入片段，均与理论值相符（大4969bp，小1485bp）。电泳结果见图2。 3.3重组质粒插入基因的序列测定利用pGEX4T1通用引物对重组质粒的插入片段进行测序，结果显示重组质粒中插入的目的片段L1基因与Genbank报告的序列和氨基酸序相同，而且L1基因插入到真核表达载体中，插入的方向正确，未改变外源基因的阅读框架。进一步证实了重组质粒为阳性重组子。 4讨论 HPV型别繁多，有100多种，其中以HPV16在子宫颈癌中最为常见，占全部HPV的50%以上，其次是HPV18，约占18%4。有文章报道HPV16感染患者发生子宫颈癌的危险是无感染者的506倍5。 HPV是具有特异性嗜上皮细胞的DNA病毒,其基因主要包括E1E7早期基因和L1、L2晚期基因，前者主要是调控基因，具有转化作用。L1、L2是结构蛋白，具有强的抗原性，为预防性疫苗研究的热点。 本研究选择HPV16东亚型的保护性抗原L1为目的基因，构建了其原核表达质粒pGEX4T1/HPVL1，通过酶切，测序等方法验证了其正确性，为下一步HPV16L1蛋白的表达奠定了坚实的基础，为HPV16L1的保护性疫苗的研究提供了有益的支持。【参考文献】 1 Bosch FX, lorincz A, Nuroz N, et al. The causal relation between human papillomavirus and cervical cancerJ. J Clin Pathol, 2002, 55(4): 244265.2 Psyrri A, Defilippis RA, Edwards APB, et al. Role of the retinoblastoma pathway in senescence triggered by repression of the human papillomavirus E7 protein in cervical carcinoma cellsJ. Cancer Res,2004, 64(9): 30793081.3 Nguyen DX, Westbrook TF, Mccance DJ. Human papillomavirus type16 E7 maintains elevated levels of the cdc25A tyrosine phosphatase during deregulation of cell cycle arrestJ.Virol, 2002, 76(2): 619633.4 Mandeblatt JS, Lawrence WF. Gaffikin costs and benefits of different strategies to screen for cervical cancer in lessdeveloped countriesJ