原核表达之宿主菌株选择指南.docVIP

原核表达之宿主菌株选择指南 在原核蛋白表达过程中，选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素：表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。事实上，在平时的实验中，最容易被忽视的就是宿主菌的选择多数人会直接选择自己实验室曾经用过的表达菌株，或者是载体配套的菌株，而不去追究原因即使表达结果不佳，大多在表达条件和载体上找原因，也不会考究菌株的选择是否适合。 作为原核表达的宿主，对外源基因的表达会产生一定的影响，是勿庸置疑的。每一个宿主细胞都像一个微观的小工厂，按照细胞固有的程序完成“你给它们安排的生产任务”因为很难亲眼观察微观世界中表达是如何进行的，当出现问题时，我们需要经验判断问题所在。宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影响呢？知其然还要知其所以然。比如，菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因，为T7表达系统而设计。真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。改造基因是比较麻烦的做法，Rosetta 2系列就是更好的选择这种携带pRARE2质粒的BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种（AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA 及CGG）稀有密码子对应的 tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。（已经携带有氯霉素抗性质粒）当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时，可以选择K12衍生菌Origami 2系列，thioredoxin reductase (trxB) 和glutathione reductase (gor)两条主要还原途径双突变菌株，显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达。（卡那霉素敏感）Rosetta-gami%26#8482; 2则是综合上述两类菌株的优点，既补充7种稀有密码子，又能够促进二硫键的形成，帮助表达需要借助二硫键形成正确折叠构象的真核蛋白。（卡那霉素敏感）Origami B是衍生自 lacZY突变的 BL21菌株，这个突变能根据IPTG的浓度精确调节表达产物，使得表达产物量呈现IPTG浓度依赖性。（四环素敏感）在决定试用这些名字古怪的菌株时，有几个小Tips要注意的，一个是不同菌株有时已经携带某个质粒或者已经具有某种抗生素抗性，要注意自己的表达质粒是否能与之兼容。比如Rosetta 2 已经携带有氯霉素抗性质粒，不能再用氯霉素筛选等等。现象可能原因改进方案建议菌株无蛋白表达E. coli 的密码子偏移性补充稀有密码子的tRNA；将稀有密码子突变为普通大肠杆菌密码子Rosetta 2Rosetta-gami 2Rosetta-gami BRosettaBlue出现截短蛋白包涵体二硫键形成困难降低宿主胞质的还原性；利用促进二硫键形成的各种载体标签Origami 2Rosetta-gami 2Rosetta-gami B表达过快，表达量过高控制优化表达水平：降温，IPTG浓度优化TunerRosetta-gami B蛋白无活性蛋白错误折叠降低宿主胞质的还原性；利用促进二硫键形成的各种载体标签Origami 2Rosetta-gami 2Rosetta-gami B控制优化表达水平：降温，IPTG浓度优化TunerRosetta-gami B细胞死亡，生长极困难毒性蛋白更严格的本底表达控制pLysS 菌株无克隆生长过高本底表达更严格的本底表达控制pLysS、pLysE 菌株重组质粒和菌株的保存建议在实验室里保存重组菌株的时候，为了挑菌和传代方便，我们常用LB平板保存在4冰箱中，需要提质粒和表达接种的时候，就直接从平板上挑菌，但是这种方法对于重组质粒的稳定性不利，容易出现质粒丢失、表达水平不稳定、菌株退化乃至发生污染等情况。 我们建议：1、 长期存放菌株和pET重组子应该存在甘油70保种。但是要注意高浓度甘油(%26gt; 10%)会导致质粒不稳定。请尽量保持甘油浓度8。（15%浓度的甘油保种液和新鲜菌液1:1就行）2、重组质粒不宜长期保存于表达菌株（带DE3的大肠杆菌）中，请尽量使用带有recA endA突变的克隆菌株（比如C600，DH5a）进行质粒抽提和保存质粒。表达型的菌株提质粒经常会有质量不高或者背景的问题。特别是大量抽提。其实不仅仅是表达，建库克隆都会涉及菌株的不同要求，推荐看看以下文章：。感受态不是目的，菌株的背景才是关键。原核表达将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。原核表达一般程序如下：获得目的基因准备表达载体将目的基因插入表达载体中（测序验证）转化表达宿主菌诱导靶蛋白的表达表达蛋白的分析扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。2、100mM IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22m滤膜抽滤，-20保存。二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。（三） 获得含重组表达质粒的表达菌种1、 将连接产物转化大肠杆菌DH5，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。2、 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。3、 以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。（四）诱导表达1、 挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50g/ml）中37过夜培养。2、按150比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中, 37震荡培养至OD6000.4-1.0（最好0.6，大约需3hr）。3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37震荡培养3hr。4、分别取菌体1ml, 离心12000g30s收获沉淀，用100l 1%SDS重悬，混匀, 7010min。5、离心12000g1min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。三 、注意事项1、选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。2、融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。51原核表达秘笈：切记重视表达前分析的重要性 摘要： 生物通原核表达技术专辑：表达不同于其它一些实验，比如：提取质粒、PCR、电镜切片，这些人为控制的因素比较多，出问题相对来说也比较好分析。表达呢，你把质粒克隆好啦，交给细胞，然后有些事情就不全是你要怎样就怎样了。原核表达在表达当中来说还是比较简单，细菌培养条件简单、生长速度快，需要的仪器和培养基都比较便宜。当然，它也存在一些缺乏高级修饰、细胞内部还原性过高等缺点。原核表达从一开始的设计就非常重要，所谓好的开始是成功的一半。做足准备功夫，可是省去很多将来后悔的事情。首先，我们要根据是否要求可溶将载体分成两大类，如果希望可以同时尝试多种表达系统，也有许多商业化的系统供选择。前面已经介绍过许多公司的商业化载体、菌株和多系统表达体系，现在我想先从自己的蛋白分析讲起。同样的载体、同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量奇高，但是另外一个就是做不出来，所以没有万能的载体，只有永恒的分析。当然如果你的蛋白曾经在原核系统中成功表达出来那是最好的，选择同样的载体表达成功率会高很多。如果没有也最好尝试找一些曾经表达过和你的蛋白拥有相类似结构的文献。比如大部分含有哺乳动物src同源的SH2蛋白相互作用域的蛋白都是用pGEX系列载体表达出来的。根据经验而言，含有较少半胱氨酸和脯氨酸的、平均大小为60kD的单体蛋白较容易表达。在下面将列出几个影响表达的因素，大家可以在表达前根据这几个因素自己分析一下：1 翻译起始位点现在大部分的表达载体都提供起始位点，所以它已经把起始密码子与核糖体结合位点的距离进行优化了，一般情况下不需要自己再加，不过还是要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子2 GC含量表达序列中的GC含量超过70的时候可能会降低蛋白在大肠杆菌中的表达水平。GC含量可以利用DNA STAR、Vector NTI Suite等软件进行预测。3 二级结构在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。如果利用软件分析DNA或RNA结构上有柄（stem）结构，并且结合长度超过8个碱基，这种结构会因为位点专一突变等因素而变得不稳定。4 基因或者蛋白的大小一般说来小于5kD或者大于100kD的蛋白都是难以表达的。蛋白越小，越容易被降解。在这种情况下可以采取串联表达，在每个表达单位（即单体蛋白）间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。如果蛋白较小，那么加入融合标签GST、Trx、MBP或者其它较大的促进融合的蛋白标签就较有可能使蛋白正确折叠，并以融合形式表达。对于另一个极端，大于60kD的蛋白建议使用较小的标签，如6组氨酸标签。对于结构研究较清楚的蛋白可以采取截取表达。当然表达时要根据目的进行截取，如果是要进行抗体制备而截取，那么一定要保证截取的部位抗原性较强。对于抗原性也可以利用软件分析，比如Vector NIT Suite或者一些在线软件，不过在分析之余也要认识到这是一种数据统计的结论，如果蛋白和免疫动物亲缘关系较远的话还是不妨一试的。5 亲疏水性这也是一种经验之谈，相信经常做表达的人都发现表达亲水区域时表达量会比较高，如果你要表达一个膜蛋白，那么劝你做好长期抗战的准备吧。有许多软件可以对氨基酸的亲疏水性进行分析，比如Vector NIT Suite，除此之外还可以利用在线跨膜区预测软件http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ 对跨膜区进行预测。对于自己表达的蛋白有所了解后就可以开始对载体进行选择了，目前商业化的载体基本上包含以下几个元件：除了上面标出的元件外还需要有复制起点，它对于控制质粒的拷贝数非常重要；另外就是筛选标记了，比如蓝白斑筛选的lacZ，各种抗生素标记。在以上几个元件中，我们需要注意的是负责调节与启动的元件，也就是调控子和启动子。其中启动子对于蛋白表达的速度起着举足轻重的作用，它与最终蛋白的表达量、是否可融密不可分。这里，对于世面上广泛销售的几种原核表达载体使用的启动子进行总结。启动子来源调控手段（浓度）强度LacUV5乳糖操纵元lacI/IPTG (0.1-1mM)强Trp色氨酸操纵元trpR 3-吲哚丙烯酸强Tac结合了色氨酸启动子的-35序列和乳糖启动子的-10序列lacI/IPTG (0.1-1mM)强PL噬菌体cI阻遏物/温度强噬菌体T5T5噬菌体lacI/IPTG (0.1-1mM)强pBAD阿拉伯糖操纵元AraBAD/阿拉伯糖（1m-10mM）严谨T7T7 RNA聚合酶lacI/IPTG (0.1-1mM)非常强乳糖操纵子是应用最广泛的调控模式，除了IPTG这种化学诱导方式之外还有利用吲哚丙烯酸和阿拉伯糖的化学诱导。如果你害怕这些化学物质会损害细菌的生长，那么你可以尝试利用温度诱导的载体，如：pDH2。它利用PL启动子，在温度上升到42后进行诱导表达。可以看到在所有启动子里属T7启动子最强，它可以将大肠杆菌的资源最大程度地调用过来表达外源蛋白。这样一些难表达的蛋白都可以在pET系统里面表达出来，但是是不是越强就越好呢？如果你需要表达蛋白是可溶的，那么T7启动子就不那么适合了。较弱的启动子转录速度较慢，这样对于表达可溶、稳定、完整的蛋白比较有利。Novagen可以说是的pET系统是最王牌的T7启动子表达系统，可是当T7启动子的强启动效应不受欢迎的时候怎么办呢？在这里给读者留个小小的疑问，看看大家有没有仔细看笔者写的Novagen篇。提示一下，虽然它转录速度快，但是可以控制它的拷贝数，又或者是利用这些原理Novagen载体也可以毒性高的外源蛋白。载体上除了启动子这个需要注意之外，另外一个就是标签了。很多标签是为了增加蛋白的可溶性，也有一些是为了方便鉴定表达产物，所以在表达时可以选择加标签。是否加标签要看个人需要，笔者认为如果是表达一个人家没表达过的蛋白最好还是加标签，这样方便将来鉴定。如果从经济角度考虑最好加入6组氨酸标签，笔者曾经以为加什么标签都无所谓（前提是不需要融合表达），结果加了个Novagen的T7Tag，等到鉴定的时候发现单抗那么贵。而且还不好买的，一些较少人用的标签会让你很伤脑筋。这也是表达前要准备的功课之一哦。好了，如果你选好了载体，那么下一步就是设计引物的。相信大多数人都是利用PCR把目的基因调出来的吧。设计引物可以使用一下两个软件，Primer Premier或者Oligo。如果要表达全长，其实也就没那么多要考虑，从一头一尾找至少8个匹配序列在加上与载体匹配的序列就可以了。不过，我还是有以下几点提醒一下各位：6 这一点其实很容易理解，但是有时也容易被遗忘。那就是先查查表达外源片段中含有什么内切酶位点，不要设计重了，否则酶切时发现怎么老是有预期外的小片段出现。7 根据载体上的酶切位点设计引物，现在许多类似T载原理的克隆方法也可以应用到原核表达中了，如果T载克隆方法要定向很多时候要多加4个碱基，设计引物时候可别忘了加。在设计酶切位点的5端不要忘了加保护碱基，不同内切酶所需的保护碱基不同，Sal不需要保护碱基，EcoR需要1个，Not需要2个，Hind最好有3个。一般情况下，都设计2个。8 注意启始密码子和终止密码子的读码框。如果载体上有ATG可以不另外加了，但是通常ATG后不是紧跟外源片段的，如果中间含有载体序列，务必确定中间这段序列不会造成你外源序列的移码。按情况需要，可以加1到2个碱基在引物中使读码框正确。有始有终，同样正常的终止密码子才能保证蛋白的产出。大部分载体也有终止密码子，如果你对载体的不放心，也可以在引物中设计上终止密码子，这样万无一失。9 还有就是设计一对引物需要注意的地方：一对引物之间Tm值相差不宜过大，能一样最好；一对引物不宜形成发夹结构、互相配对，若配对时最好不要是G-C的结合（可以用软件分析）；3端以G、C结尾为宜等等。如果要详细研究可以看一下PCR技术的相关书籍，很厚。还有就是记得把上游引物设计成有义链，下游设计成反义链，否则就没有片段出现了。虽然这是很小的地方，可是经常会被忽略。10 如果你是进行截取表达，那么除了之前提到的要注意截取亲水区，还有一点就是对密码子的使用频率进行分析。如果在大肠杆菌中使用较少的密码子在外源片段中连续出现，还是避开它为上策。看完这么多是不是觉得有点思绪万千呢。以前给我上课的一位教授说过，做试验，那要大胆设计，小心求证。快去合成引物开始表达吧。万一表达不出来，我这还有下篇呢。pET载体，原核表达金标准对于全世界许多研究者， Novagen的 pET系统已成为在大肠杆菌中蛋白表达的首选。该系统成功的一个主要原因是目标基因被克隆到不为大肠杆菌 RNA聚合酶识别的 T7启动子之下，因此在加入 T7 RNA聚合酶之前几乎没有表达发生。克隆到 pET载体的基因实际上是被关闭的，不会由于产生的蛋白对细胞有毒性而引起质粒不稳定。重组质粒转移到染色体上含有一拷贝由 lacUV5控制的 T7 RNA聚合酶基因的表达宿主中，并通过加入 IPTG诱导表达；也可通过 l CE6感染原始克隆宿主菌来提供 T7 RNA聚合酶。使用大肠杆菌启动子系统 (如 tac、 lac、 trc、 pL)有困难的许多基因已经在 pET系统中稳定克隆和表达。 T7 RNA聚合酶的选择性和活性使得几乎所有细胞资源都用于为目标基因表达。诱导后几小时目标产物就可超过细胞总蛋白的 50%。新开发的 T7驱动表达技术以 pETBlue TM系统为代表。 pETBlue载体包括了 pET用于表达的优点，在目标基因克隆和质粒 DNA操作的方面更为方便。pETBlue TM系统：新一代T7表达载体pETBlue载体代表了新型表达载体，它具备所有广受欢迎的克隆载体的最理想特点和 T7驱动蛋白表达的完全功能。目标基因以相对于修饰的大肠杆菌 tet启动子的反义方向插到 lacZ a -肽编码区，因此可进行蓝 /白斑筛选。正确定位于目标基因正义方向上游的 T7转录和翻译信号使表达成为可能。与标准 pET载体一样，通过转化 DE3溶原菌并用 IPTG诱导或通过 l CE6感染原始宿主菌生产目标蛋白。优点蓝 /白斑筛选，便于克隆高拷贝数，质粒 DNA高产以 AccepTor TM载体或 perfectly Blunt a载体形式提供，便于快速 PCR克隆目标基因无基础水平表达，消除了毒性基因产物相关的质粒不稳定性表达水平与经典 pET载体相同用 Tuner TM (DE3)pLacI宿主菌实现真正的表达水平“变阻器”控制。PET系统：大肠杆菌中蛋白表达的金字招牌pET载体中，目标基因克隆到 T7噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供 T7 RNA聚合酶来诱导表达。 Novagen的 pET系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括 36种载体类型、 15种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。优点是原核蛋白表达引用最多的系统在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低真正的调节表达水平的“变阻器”控制提供各种不同融合标签和表达系统配置可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌许多载体以 LIC载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆 PCR产物许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化阳性 pFORCE TM克隆系统具有高效克隆 PCR产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。pETBlue TM系统T7驱动的严紧控制表达、蓝 /白斑筛选、质粒产量高新颖的 pETBlue TM系统兼有广受欢迎的蓝 /白斑筛选载体所具有的通过目测确定重组体和高质粒拷贝数，以及 pET载体严紧控制的高蛋白表达等特点。蓝 /白斑筛选通过使用弱组成型大肠杆菌启动子 ( tet)驱动lacZa -肽表达而实现，而目标基因表达由相反方向的 T7启动子驱动。目标序列插入多克隆位点（ MCS）破坏了lacZa -肽的表达，在NovaBlue菌株中当存在 x-gal时产生白菌落表型，而带有非重组载体的菌落变蓝。由于 T7驱动的蛋白表达要求插入片段克隆到相对于tet启动子的反义方向，因此实际上没有目标序列的基础表达。相对于 pET载体， pETBlue质粒上高拷贝 PUC复制起点增加了质粒产量，为测序、突变和其它质粒操作带来方便。如果插入序列相对于 T7 lac启动子为正义方向且符合每个载体的翻译要求， pETBlue载体中目标基因可以高水平表达。用两种方法进行蛋白表达：用 l CE6（ l pL启动子控制 T7 RNA聚合酶表达的噬菌体）感染，或转化重组 pETBlue质粒到宿主菌 Tuner TM (DE3)pLacI或 Origami TM (DE3)pLacI中并用 IPTG诱导。这些宿主菌染色体上带有一拷贝lacUV5控制的 T7 RNA聚合酶基因，并通过相容的 pLacI质粒提供足够lac阻遏蛋白，以确保低水平的未诱导表达。 Tuner菌株的lacY状态使整个培养细胞被均一的诱导，并随 IPTG剂量诱导有不同的蛋白表达水平。 Origami菌株能够增强胞质中二硫键形成。pETBlue-1pETBlue-1便于从 5端编码开放读码框架的插入片段表达未融合的天然蛋白。该载体 EcoR V (GATATC)克隆位点位于强 T7基因 10核糖体结合位点（ RBS）附近。含有 ATG起始密码子或 5端具有一个位置合适的 G核苷酸插入片段成为一个合适的大肠杆菌翻译起始位点。pETBlue-2pETBlue-2提供了载体编码的 ATG起始密码子和多种下游克隆位点。 MCS 5和 3端两套各三个重叠平末端酶切位点便于将任何插入片段克隆到读码框中。在载体确定的读码框中，这些酶产生的平末端终止于密码三联体的不同位置。因此只要插入方向正确，任何插入片段可克隆到经过合适平末端酶切割的载体的读码框中。而且，任何不含内部终止密码子的插入片段都可与 C-末端 HSV.Tag a表位和 His.Tag a序列克隆到同一读码框中。pETBlue TM PCR克隆试剂盒方便地将 PCR扩增 DNA直接克隆到 pETBlue载体中除了含有未切割质粒的 pETBlue TM系统， Novagen还提供可立即插入 PCR产物的 pETBlue载体。已有两种试剂盒： AccepTor TM载体试剂盒能够插入带单个 3 -dA突出的 DNA，如非校对 DNA聚合酶 (如 Taq DNA聚合酶 )的扩增产物；而 perfectly Blunt a克隆试剂盒设计用于克隆任何末端形式的插入片段。在pETBlue-1 AccepTor载体中表达插入基因的引物设计：pETBlue-1：用 5端 ATG开始的正义引物进行扩增，能够确保在大肠杆菌中有效合成蛋白的 RBS和翻译起始位点之间的最适距离。目标序列羧基端引物设计没有限制。Met-正义引物 5 -ATG XXX -反义引物无限制pET系统概述pET系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由 Studier等开发的 T7启动子驱动系统， Novagen的 pET系统已用于表达成千上万种不同蛋白。控制基础表达水平pET系统提供 6种载体 -宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。宿主菌株质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有 T7 RNA聚合酶基因的宿主菌（ DE3溶原菌）中表达目标蛋白。在 DE3溶原菌中， T7 RNA聚合酶基因由 lacUV5启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有 pLysS和 pLyE时调控会更严紧。 pLys质粒编码 T7溶菌酶，它是 T7 RNA聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。 pLysS宿主菌产生低量 T7溶菌酶，而 pLysE宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的 DE3溶原菌。有 11种不同DE3溶原化宿主菌。使用最广泛的为 BL21及其衍生菌株，它的优点在于缺失lon和ompT蛋白酶。 B834菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用 35 S-甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。 BLR为recA-衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶 ( trxB)突变菌株 (AD494,BL21 trxB)，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。Origami TM和 OrigamiB菌株为trxB/gor双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。 Origami和 OrigamiB宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的 Rosetta TM菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的 tRNA，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括 K-12菌株 HMS174和 NovaBlue，象 BLR一样为recA-。这些菌株可稳定表达其产物可能导致 DE3噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在 F附加体编码的高亲和力lacIq阻遏蛋白， NovaBlue为一个有用的严紧型宿主菌。此外， Novagen提供了 DE3溶原化试剂盒，用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。表达高毒性基因或制备新的 DE3溶原菌的另一替代方法是通过 l CE6感染提供 T7 RNA聚合酶。虽然不如用 IPTG诱导 DE3溶原菌方便，这种策略也被优先用于一些应用中。高严紧性T7lac启动子除了在宿主菌水平选择三种基本的表达严紧性， pET系统中 T7启动子本身提供了两种不同的严紧性选择：普通 T7启动子和 T7 lac启动子。 T7 lac启动子在启动子区下游 17bp处含有一个 25bp的lac操纵序列。该位点结合lac阻遏蛋白能够有效降低 T7 RNA聚合酶的转录，这样提供了在 DE3溶原菌中抑制基础表达的第二种基于lacI的机制（除了抑制lacUV5）。含 T7 lac启动子的 pET质粒还具有它们自己的lacI，确保足够的阻遏蛋白结合到操纵基因位点上。在实际应用中，为了获得最高产量的蛋白，通常应该测试多种不同的载体 /宿主菌组合。控制诱导的表达水平在许多情况下，表达活性可溶性最好的蛋白依赖于宿主细胞的背景、培养条件和合适的载体配置。通常，目标蛋白活性最高的条件与产量最高的条件不一致。除了根据载体 /宿主菌组合控制 T7 RNA聚合酶的基础表达提供不同严紧性， pET系统还根据诱导物（ IPTG）浓度，对目标蛋白表达提供了真正的“变阻器”控制。 Tuner和 OrigamiB宿主菌的lacY突变使这种控制成为可能。选择pET载体所有的 pET载体均来自 pBR322，但彼此间先导序列、表达信号、融合标签、相关限制性位点和其它特点有所不同。有两大类 pET质粒，即转录载体和翻译载体：转录载体（包括 pET-21、 pET-23和 pET-24）表达目标 RNA，但不提供翻译信号。它们用于从自身带有细菌翻译信号的目标基因表达蛋白。（注意：转录载体通过命名后面的一个缺失字母后缀加以区分）翻译载体含有设计用于蛋白表达的有效翻译起始信号。许多载体在读码框 a、 b和 c中带有克隆位点，分别对应于 BamH I位点的 GGA、 GAT和 ATC三联体。选择要点选择用于表达的 pET载体通常涉及多种因素。考虑以下三个主要因素：所表达蛋白的用途所表达蛋白的已知信息克隆策略pET载体表达的蛋白用途各种各样。例如，表达量为分析级的蛋白可用于活性研究、突变体筛选和定性、筛选配体相互作用和抗原制备。大量活性蛋白用于结构研究、试剂或亲和基质制备。许多载体适合表达用于筛选或抗原制备的分析量蛋白，然而只有载体、宿主菌和培养条件组合十分适宜才可能用于大量纯化。如果需要活性蛋白连续高产，应该试验多种载体、宿主菌和培养条件组合以找到最优化结果。任何关于目标蛋白的已知信息都有助于载体选择。例如，一些蛋白的活性要求一个或两个末端没有外源序列。许多 pET载体能够克隆非融合序列，然而如果特定翻译起始序列不能在大肠杆菌中有效利用，表达水平可能受影响。在这些情况下，常可用有效表达的氨基末端序列构建融合蛋白，然后在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列。 LIC（连接非依赖的克隆）策略对这种方法特别有用，因为克隆操作通过肠激酶和因子 Xa能够去除所有氨基端载体编码序列。由于限制性位点和读码框相容性的需要，克隆策略也会影响载体选择。由于许多 pET载体具有共同的限制性位点配置，通常可能将一次制备的目标基因克隆到几个载体中。采 PCR克隆策略时则有不同的考虑。 LIC载体试剂盒推荐用于此目的，可通过 PCR制备插入片段，而不需要限制性消化载体或插入片段。溶解性和细胞定位考虑了目标蛋白的应用和克隆策略，还应该确定目标蛋白的细胞定位和溶解性，这一点十分重要。在许多实际应用中常希望表达可溶的活性蛋白。特定目标蛋白的溶解性取决于多种因素，包括各自的蛋白序列。在许多情况下，溶解性不是有或无的现象，载体、宿主菌和培养条件可被用来增加或减少获得的可溶或不可溶形式的比例。 PET-32载体系列使目标序列与通常能够增加可溶性蛋白比例的硫氧还蛋白 (Trx.Tag )融合。新推出的 pET-43.1系列具有通过大量系统筛选而得到的一种过量表达时具有极高溶解性的大肠杆菌蛋白 -Nus.Tag融合伴侣，从而进一步提高了目标蛋白的可溶性。此外，trxB突变株 AD494和 BL21 trxB，或trxB/gorOrigamiTM和 OrigamiB菌株可用于在胞浆中形成许多真核蛋白正确折迭和活性所要求的二硫键。低温诱导（ 15 -25 C）也可增加可溶性目标蛋白的比例。获得可溶性活性蛋白的另一策略是使蛋白外泌到胞外周质中，为折迭和二硫键形成有更适宜的环境。为了达到这一目的，通常使用带信号肽的载体。一些纯化策略可以优化胞质中不溶性包涵体的产量。抽提包涵体并溶解，然后目标蛋白在体外重新折迭 (如使用 Novagen的蛋白折迭试剂盒 )。该过程通常产生高产量初始蛋白并防止宿主细胞中的蛋白降解。然而，重新折迭成活性蛋白的效率随不同蛋白变化很大，可能相当低。 pET-31b（ +）载体专为产生不可溶融合蛋白而设计，提供了生产小蛋白和多肽的有效方法。满足不同需要的融合标签如果融合序列不影响应用，生产带有 S.Tag、 T7.Tag a、 His.Tag a和 HSV.Tag a的融合蛋白会很方便后续操作，并易于通过蛋白杂交检测。这些多肽（融合序列很小），它们的检测试剂极特异和灵敏。通过使用相应树脂和缓冲液试剂盒， GST.Tag、 S.Tag和 T7.Tag序列可用于亲和纯化。使用 S.Tag和 GST.Tag分析试剂盒可对粗提或纯化的融合蛋白准确定量。采用一种新颖底物的 FRETWorks S.Tag分析试剂盒可通过荧光检测到少于 1fmol的融合蛋白。His.Tag a序列作为纯化蛋白的融合伴侣非常有用，尤其对那些以包涵体形式表达的蛋白来说，它可以使亲和纯化可在溶解蛋白的完全变性条件下进行。CBD.Tag a在低费用亲和纯化中非常有用。它们也特别适用于重新折迭（特别是带有 CBD clos .Tag a序列的 pET-34b（ +）和 35b（ +）。因为只有正确重新折迭的 CBDs结合到纤维素基质上， CBIND亲和纯化步骤能够从制备物中去除不正确折迭的分子。任何标签可用于固定目标蛋白，但由于 CBD.Tag序列的低非特异性结合以及与纤维素基质的生物相容性，使它更适合用于这一目的。Nus.Tag、 Trx.Tag和 GST.Tag序列用来增加其融合伴侣的溶解性。 Nus.Tag和 Trx.Tag载体与利于在胞浆中形成二硫键的 Origami宿主菌相容。各种融合标签和相应 pET载体见列表。一些 pET载体带有数个串联的融合标签，作为 5融合伴侣。此外，许多载体通过目标基因序列符合读码框的通读而表达末端带有不同多肽标签的融合蛋白。使用在 5标签和目标序列之间含有蛋白酶切割位点（凝血酶、因子 Xa和肠激酶）的载体，可以在纯化后选择性去除一个或多个标签。 pET-30 Ek/LIC、 pET-32 Ek/LIC、 pET-34 Ek/LIC和 pET-36 Ek/LIC是细胞定位和亲和标签配置良好的代表。 pET Ek/LIC载体 Combo试剂盒包括所有 4种即用型载体，可直接用于构建数种目标基因构型。pET NusA融合系统43.1在大肠杆菌中生产可溶性活性蛋白新推出的 pET NusA融合系统设计用于克隆和高水平表达与 495aa NusA（ Nus.Tag）蛋白融合的多肽序列。对数据库中 4000个以上蛋白进行可溶性建模， NusA蛋白被确认为具有最高的可溶性。在用四种不同 NusA融合蛋白进行的试验中，大于 85%的表达蛋白都是可溶的。 pET-43.1载体含有 Nus.Tag融合伴侣并与trx/gor突变体 Origami和 OrigamiB菌株相容，有利于在胞浆中形成二硫键。使用 pET-43.1载体和这些trx/gor宿主菌组合可能获得二硫键结合的蛋白。优点高可溶性的 N-末端 Nus.Tag融合伴侣上游 His.Tag a、 S.Tag和可选择的 C-末端 HSV.Tag a、 His.Tag融合标签凝血酶和肠激酶切割位点多克隆位点位于所有读码框中与 AD494和 Origami宿主菌株相容，可促进表达蛋白的正确折迭pET宿主菌株感受态细胞所有 pET系统宿主菌以预测试的感受态细胞形式提供，可立即用于转化。（ DE3）指宿主为 DE3溶原菌，其染色体上带有一拷贝由lacUV5启动子控制的 T7 RNA聚合酶基因。这类菌株适用于从克隆到 pET载体的目标基因生产蛋白。命名为 pLysS和 pLysE的宿主菌带有编码 T7溶菌酶（为 T7 RNA聚合酶的天然抑制物）的 pET相容性质粒。带有 pLysS的细胞产生少量溶菌酶，而 pLysE宿主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制 T7 RNA聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的 pET重组体。带有 pLacI的宿主菌产生额外的抑制 pETBlue和 pTriEx载体基础表达的lac阻遏蛋白。 DE3溶原化试剂盒用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。AD494菌株为硫氧还蛋白还原酶 ( trxB)突变菌株，能够在胞浆内形成二硫键，提供了生产正确折迭的活性蛋白的潜力。TrxB突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla的质粒。B834为 BL21的亲本菌株。这些蛋白酶缺陷宿主菌为甲硫氨酸营养缺陷型，可用 35 S-甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记，从而用于结晶学研究。BL21应用最广的宿主菌来源，具有lon和ompT蛋白酶缺陷的优点。BL21TrxB菌株在蛋白酶缺陷 BL21背景上具有与 AD494菌株相同的硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB)。由于trxB宿主有利于胞浆内二硫键形成，它们的使用可增加正确折迭的蛋白组分。TrxB突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla的质粒。BLR为 BL21的recA-衍生菌株，能够改善质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列或其产物能够引起 DE3噬菌体丢失的目标质粒。HMS174菌株在 K-12背景上提供了recA突变。与 BLR一样，这些菌株能够稳定其产物能够引起 DE3噬菌体丢失的某些目标基因。NovaBlue适合用作初始克隆宿主菌的 K-12菌株，具有高转化效率、蓝 /白斑筛选能力（与合适质粒）和导致优质质粒 DNA高产的recA endA突变。由于存在 F附加体编码的 lacI q阻遏蛋白， NovaBlue的 DE3溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。Origami为 K-12衍生的宿主菌，硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB)和谷胱甘肽还原酶 ( gor)基因均为突变，能够大大增强胞浆内二硫键的形成。研究表明即使总体表达水平相似， Origami（ DE3）表达的活性蛋白比其它宿主菌高 10倍以上。 Origami宿主菌与氨苄抗性质粒相容，可用于 pET-32载体，硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。TrxB和gor突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla的 pET质粒。Origami B宿主菌来源于 BL21 lacZY突变株，还带有与原始 Origami菌株相同的TrxB/ gor突变。 Origami B菌株集 BL21、 Tuner和 Origami宿主菌的优点于一体。TrxB和gor突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla的 pET质粒。Rosetta宿主菌从 BL21衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子 AUA、 AGG、 AGA、 CUA、 CCC和 GGA的 tRNAs。这样 Rosetta菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。 tRNA基因由它们的天然启动子驱动。在 Rosetta（ DE3） pLysS和 Rosetta（ DE3） pLacI中，稀有 tRNA基因存在于分别带有 T7溶菌酶和lac阻遏基因的同一质粒上。Tuner菌株为 BL21的lacZY缺失突变株，能够调整培养物中所有细胞的蛋白表达水平。lac通透酶（lacY）突变使得 IPTG均匀进入群体所有细胞，从而具有浓度依赖、水平均一的诱导表达。通过调整 IPTG浓度，表达可从极低水平调节到极强、完全诱导的表达水平（通常与 pET载体相关）。低水平表达有时可能增强难表达蛋白的溶解性和活性。 Tuner（ DE3） pLacI菌株与 pETBlue和 pTriEx载体的表达相容。原核表达遇到瓶颈怎么办 我想表达遇到的第一个瓶颈估计就是为什么我的外源片段插到载体里面，PCR鉴定没问题，双酶切也OK，可是就是不见表达。一般我们是如何判断没有表达呢？大多都是首先进行SDS-PAGE。在跑胶的时候一定要设对照，比较严谨的电泳对照，应该是：Marker，标准品阳性对照（如果有，且打算做Western的话），以及空白载体（诱导）和重组载体（不诱导）2个阴性对照，再加上诱导不同时间的表达结果。Marker用于判断条带大小，标准品用于判断Western体系包括抗体显色剂和操作的可靠性，以及精确判断大小；空白载体（诱导）负对照有助于判断在非诱导条件下的本底表达；而重组载体（不诱导）负对照则有助于判断诱导的效果以及排除诱导剂对宿主菌潜在的干扰，或者是区分细菌内源和外源表达产物偷懒可不是好习惯，会影响结果判断。注意，接种表达和接种做感受态都类似，一定要用挑单克隆、加足量抗生素、过夜培养的新鲜菌液转种最好，在筛选压力下生长旺盛的种子液远比经过4保存的菌液要好得多，也许是因为保存时间长会导致抗生素失效部分细菌丢失质粒或者其他变化。反正就是一种经验做法。跑SDS-PAGE的话可以用考马斯亮兰染，它灵敏度在100ng左右；但是不能跟着做Western了。银染的灵敏度在0.11 ng；有钱还可以用Sypro Red，灵敏度高还可以继续做Western。在做过Western Blot仍没有检测到表达带，那么就要开始进行下一步的分析了。首先，看看载体的多克隆位点和片断插入的序列，是否有因为酶切连接而意外引入了转录终止信号。有时载体几经多个实验人员的周转，反复插入片断，或者是粘端相同的不同酶切片断之间的连接，会意外在启动子后面带入终止位点，特别是用到XbaI之类的酶要小心。然后要对测序结果进行确定，确定插入的每个碱基都是正确的，没有意外终止的情况。还有个大家容易忽略的问题：就是要看基因中有没有细菌不常用的密码子如果有，需要考虑换表达菌株。每种菌株都有自己独特的设计，或者是蛋白酶缺陷，或者是重组酶缺陷，改造的目的都是为了让质粒在细菌中存在更稳定，表达的产物不易被降解。不同的载体要配合一定的菌株使用，像pET系列就一定需要有T7 RNA聚合酶片段整合在细菌中的菌株才可用于表达。采用不同调控机制会使用不同的表达菌株，所以换菌株一定要仔细看过载体的调控方式再换。以Novagen为例，如果使用BL21(DE3)表达不成功的话可以换Rosetta系列菌株，它能够由一种氯霉素抗性的、与pET相容的质粒提供AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA的tRNA。所以这类菌株能够明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成的表达限制。有时不明原因的表达蛋白截短（比预期的分子量要小很多）也可能是由于稀有密码子造成的。另外一种可能是不严谨的本底表达产物抑制。没有发现原则性错误之后，最简单、快捷的就是改变一下表达温度、IPTG浓度。低温、较长时间的表达有利于蛋白稳定、融合表达，低浓度的IPTG可以减少化学物质对细胞的损伤。培养基中的葡萄糖可能会抑制表达。有时表达的蛋白可能比预期的有不同，要认真研究电泳结果。如果尝试改变条件后依然没有表达，可以试试换不同的培养基。除了LB外还有TB、M9等，Novagen公司还有特殊的培养基出售补充各种细菌生长所需营养。如果还是不行，考虑那么就剩下换换载体或者表达系统了。在换过不同载体，不同菌株之后仍是表达不出来的话，笔者的建议是：放弃吧。有些蛋白