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小鼠白细胞介素-12基因在乳酸乳球菌中的表达 作者：周强，周巧梅，李云，庞庆丰，曾因明 【摘要】 目的 在乳酸乳球菌中表达小鼠白细胞介素-12基因。方法 用Nsi 和EcoR 双酶切pGEM-IL-12质粒后，与经同样酶切的含有乳链杆菌肽A（nisA）启动子的pSEC-E7质粒连接，从而构建成pSEC-IL-12质粒；经电击转化，将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中，转化子在含有氯霉素的脑心浸液培养基上培养。用乳链杆菌肽（nisin）诱导白细胞介素-12表达，SDSPAGE、Western blot鉴定表达产物；用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测IL-12的量。结果 建立了白细胞介素-12乳酸菌基因表达系统。在nisin的诱导下，NZ9000能够产生并分泌白细胞介素-12约80 ng/。结论 乳酸乳球菌能够表达一定数量的小鼠白细胞介素-12。 【关键词】 白细胞介素-12；基因克隆；乳酸乳球 白细胞介素-12（interleukin 12， IL-12）主要由B 细胞、T 细胞、单核巨噬细胞产生的一种具有多种功能的细胞因子。它能够促进NK细胞、T 细胞的增殖和杀伤活性， 诱导-干扰素等细胞因子的产生， 调节Th1 细胞的发育， 具有良好的临床应用前景。目前已经进入抗肿瘤、抗病毒性疾病和治疗哮喘的期和期临床试验阶段15。人重组IL-12 （recombinant human interleukin-12， rh IL-12）的临床试验提示rh IL-12在治疗肿瘤、病毒感染性疾病及哮喘中具有肯定的效果。国内、外均采用基因工程的技术使用逆转录病毒和重组腺病毒载体介导的方法在COS - 7细胞、肝癌细胞株中进行体外表达得到rh IL-126-7。但存在着成本昂贵、操作技术复杂、表达量较低、需多次提取纯化才能使用等缺点。而如果将携带rh IL-12的逆转录病毒或重组腺病毒载体静脉注射或局部注射使rh IL-12在体内表达，则存在的主要问题是:转移效率低，免疫原性强，外源基因在细胞中只能短期表达8-9。因此寻找一种简便而又实用的开发rh IL-12的方法使其尽快成为一个新的药物非常重要。近年来，人们在研究乳酸菌的过程中所建立的乳酸菌基因表达系统为有效地开发和利用rh IL-12提供了新的机遇。本研究报道了小鼠 IL-12 基因在食品级微生物乳酸乳球菌中的活性表达，从而为以乳酸乳球菌为基础的IL-12应用研究提供依据。 1 材料和方法 1.1 质粒、菌株及培养条件 乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）NZ9000和pSEC-E7质粒为法国农业科学院Luis教授赠送，大肠杆菌DH5、pGEM-IL-12载体为本实验室保存；其中大肠杆菌DH5用于质粒pSEC-E及其衍生质粒保存或扩增的标准菌株，乳酸乳球菌NZ9000 用作IL-12基因重组表达质粒pSEC-IL-12的表达菌株。大肠杆菌用LB培养基、乳酸乳球菌及其电穿孔转化子用脑心浸液培养基培养。氨苄青霉素使用浓度为100 mg/L，氯霉素使用浓度大肠杆菌为10 mg/L、乳酸乳球菌为5 mg/L。IL-12酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自上海森雄公司。 1.2 重组质粒的构建及转化 重组质粒构建如下：用Nsi 和EcoR 双酶切pGEM-IL-12 质粒后，与经同样酶切的含有nisA启动子的pSEC-E7质粒连接，从而构建成pSEC- IL-12质粒，pSEC- IL-12质粒含有Usp45 信号肽。乳酸乳球菌转化采用电穿孔转化法，电穿孔仪为美国Bio-Rad公司，脉冲参数为1.25 kV/mm，25 F和200 。重组质粒经电击转化乳酸乳球菌NZ9000，转化子在含有氯霉素的脑心浸液琼脂糖平板上生长。再从重组乳酸乳球菌中提取质粒 pSEC- IL-12，进行电泳鉴定。 1.3 小鼠HO-1基因在乳酸乳球菌中的诱导表达 含重组质粒pSEC- IL-12的乳酸乳球菌NZ9000在脑心浸液培养基中30静置培养过夜,用新鲜培养基150稀释，培养至OD6000.50.6时，加入诱导物Nisin至终浓度10 mg/L，继续培养3 h。终止培养后，取2 ml培养菌液，4、8 000 r/min离心5 min，上清液浓缩50倍后经15SDS-PAGE电泳分离后，通过Bio-Rad 印迹仪转移至硝酸纤维素膜上作Western- blot。以空载体Lactococcus lactis为对照。取1 ml培养菌液用ELISA试剂盒测定IL-12的产量。 2 结 果 2.1 IL-12在细菌中的转化，提抽，鉴定 将pSEC-IL-12转化至DH5中，提抽质粒并做DNA测序，测序结果见图1，碱基数目及顺序与预期设计结果相符合，在LB培养基平板上大量扩增细菌并提取获得质粒，将其再转化到NZ9000。从NZ9000中提取质粒做电泳鉴定（图2）。由图2可见，在DH5和NZ9000中提抽到的质粒DNA分子（条带1和2）与转化前的pSEC-IL-12（条带1）在Marker的对照下，条带处于同一位置高度，说明转化是成功的。 2.2 IL-12蛋白质的表达 在Nisin的诱导下，NZ9000能够产生并分泌rmIL-12约80 ng/L（见图3），和野生菌比较，Western blot分析含目的基因的工程菌组在相应部位分子量处有条带出现，而野生菌组则不明显（图4）。 3 讨 论 乳酸乳球菌是一类长期应用于食品发酵业的有益微生物，这种食品级微生物能经受胃肠液考验并在人体内存活2 3天，其本身不攻击肠黏膜并且不引起强的免疫反应10。近年来随着乳酸乳球菌分子生物学迅速发展，一系列乳酸乳球菌基因表达载体和受体系统逐步建立。乳酸菌存在数种食品级基因表达系统，如依赖lac操纵子控制的食品级表达系统、nisA启动子控制的食品级基因表达系统和嘌呤调节的食品级基因表达系统等。 本研究所采用的乳酸菌表达系统是一种目前国际上高度通用NICE系统（nisin controlled expression system）。该表达系统包括3种必要的组成成分：能表达NisR基因到一定水平的革兰阳性细菌NZ9000；（nisA） 启动子片段的质粒载体；Nisin诱导物，即Nisin作为自身结构基因转录激活的信号分子。由于NICE表达系统具有食品级的诱导物和宿主菌、严谨性高、本底表达水平低、诱导效率高及表达产量高等优点，所以被广泛地用于外源性基因在乳酸乳球菌中表达。由于具有自身分泌的蛋白少且不含质粒的菌株不产生胞外蛋白水解酶等优点，所以越来越多的学者将乳酸乳球菌作为异源性蛋白表达载体。目前已有多种异源性蛋白在乳酸乳球菌中成功表达11-12。然而，如果把乳酸乳球菌用作人类或动物消化道中的蛋白载体，那么乳酸乳球菌能够分泌异源性蛋白则是更佳选择，因为这样将更有利于异源性蛋白与其靶位相互作用。正如其他革兰阳性细菌，乳酸乳球菌分泌的蛋白首先被合成前体蛋白，即含有信号肽和成熟的蛋白分子；然后宿主分泌系统识别前体蛋白并将其跨膜转运；最后成熟蛋白释放至培养基中。因此，信号肽在乳酸乳球菌蛋白分泌中起至关重要作用。本实验成功重组了能够表达具有生物活性IL-12乳酸乳球菌，鉴于乳酸乳球菌为存在于胃肠道中的益生菌，因此非常适合于治疗肠道疾病如肠炎、肠道肿瘤等疾病。但本研究也发现乳酸乳球菌表达的IL-12含量偏少，因此需要进一步优化诱导表达条件，增加IL-12的表达数量。 【参考文献】 1 OBrien CB， Moonka DK， Henzel BS， et al. 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