穹窿切断并摘除肾上腺后大鼠下丘脑CRH表达变化.doc

穹窿切断并摘除肾上腺后大鼠下丘脑CRH表达变化 作者：张彦慧,石玉秀,郑小桃,符皎荣,钟南田,洪灯【摘要】 目的：观察下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin releasing hormone, CRH）与糖皮质激素的关系，探讨海马参与HPA轴调节的机制。方法：建立大鼠穹窿切断模型，采用ELISA方法检测穹窿切断0、4、7、10d血中糖皮质激素的浓度;建立大鼠穹窿切断同时摘除肾上腺7d的模型，采用免疫组织化学、免疫印迹方法检测CRH的表达变化。结果：穹窿切断7d后血中糖皮质激素的浓度升高，穹窿切断同时摘除肾上腺7d后，下丘脑CRH表达升高。结论：海马通过穹窿对HPA 轴发挥负反馈调节作用，糖皮质激素负反馈调节下丘脑CRH。 【关键词】 穹窿切断术；穹窿切断并摘除肾上腺； 促肾上腺皮质激素释放激素；下丘脑ABSTRACT Objective: To observe the relation between corticotropin releasing hormone （CRH） and glucocorticoid and to explore the mechanism of the hippocampus involved in HPA axis regulation. Methods: The fornix was transected to establish a animal model，ELISA was used for detection of glucocorticoid concentrations on day 0，4，7 and 10 after fornix transaction. Immunohistochemical method and Western Blotting were respectively used for the expression of CRH in the hypothalamus after fornix transection and adrenalectomy. Results: Glucocorticoid concentration was increased on the 7th day after fornix transection. The expression of CRH was upregulated on the 7th day after fornix transection and adrenalectomyon. Conclusions: The hippocampus provides a negative feedback to the HPA axis through fornix , the glucocorticoid has a negative feedback effect on CRH. KEY WORDS Fornix transection; Fornix transection and adrenalectomy; Corticotropin releasing hormone; Hypothalamus 应激反应是以下丘脑 垂体 肾上腺 (hypothalamicpituitaryadrenal, HPA)轴的激活为核心的生理和心理反应。应激后促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)在HPA轴中发挥重要作用, 控制着HPA轴的兴奋水平1。研究表明海马对HPA轴有负反馈调节作用，可能是因为海马媒介穹窿对下丘脑室旁核产生了抑制作用。本课题组前期实验通过建立大鼠穹窿切断模型，观察到穹窿切断7d后，下丘脑室旁核神经元CRH的表达升高，10d升高显著2，3。此结果提示我们，穹窿切断后海马对下丘脑室旁核的抑制作用减弱, 室旁核合成CRH增多, HPA轴活动增强。但是血中糖皮质激素的浓度升高是否是HPA轴活动增强的结果，这一点还未曾证实。本实验建立大鼠穹窿切断模型，检测糖皮质激素浓度变化情况，以进一步验证海马是否媒介穹窿对下丘脑室旁核产生了抑制作用。此外通过实施穹窿切断术同时摘除其肾上腺，观察CRH的表达变化，研究糖皮质激素与CRH的关系，为研究揭示应激的变化机理提供一定的理论和实验依据。1 材料和方法1.1 动物及分组 成年健康雄性Wistar大鼠90只， 200220g，购于中国医科大学实验动物中心，实验室条件饲养，随机分为12组，即穹窿切断0、4、7、10d组、相应假手术组和相应正常组，每组5只，共60只，用于ELISA检测。剩余大鼠随机分为穹窿切断并摘除肾上腺7d组、相应假手术组和相应正常组。每组10只，共30只，用于免疫组织化学和免疫印迹法各半。1.2 实验方法1.2.1 穹窿切断动物模型将大鼠用戊巴比妥麻醉后，固定于江湾IC型脑立体定位仪，常规消毒、剪毛，正中切开头皮，暴露出颅骨，于前囟后1.5mm，中线外左右1.0mm处，用电动开颅器凿开颅骨，切开硬脑膜，自制的双刃刀置于上述部位的脑表面（相当于穹窿部位），续降刀6mm，切断穹窿，降刀时间约1min，假手术组降刀2mm（未切穹窿），刀在脑中均停留5min。清洁颅面，缝合头皮，常规饲养，抗生素控制感染4。1.2.2 穹窿切断并摘除肾上腺模型建立穹窿切断动物模型后，将大鼠俯卧位固定于蛙板上。从最后胸椎处向后沿背部正中线做约2cm长的皮肤切口。在肾前内侧脊柱下方找到淡黄色的肾上腺并摘除, 同法摘除右侧肾上腺(位置稍靠前) , 缝合肌肉和皮肤, 并涂以碘酊。假手术组进行与实验组相似的手术，但不摘除肾上腺。术后保持室温为2125, 以葡萄糖、生理盐水代替饮水5。1.3 ELISA 检测血清糖皮质激素水平 取穹窿切断大鼠眼窝静脉丛血液，每次采血0.5mL，消毒棉球压迫眼球止血30s。采血后离心取血清，相应反应板孔中加入20L标准品，20L血清标本，每板孔再加入200L酶联物，室温 60min。洗涤液洗涤反应板，每孔加入100L显色液，室温温育15min。每孔加入100L终止液。轻轻混匀30s；60min内450nm处读OD值，再换算成质量浓度。1.4 免疫组织化学SABC法显色 穹窿切断并摘除肾上腺大鼠施心灌流、固定，用恒冷箱切片机（型号Leica）制作冷冻切片，厚14m，3%H2O2甲醇20min、0.03% Triton X100浸泡10min，5BSA 封闭20min后，滴加CRH抗体（工作浓度为1:500），阴性对照组加0.01mol/L PBS代替一抗，4孵育过夜, 滴加二抗IgG 37、20min，滴加SABC 37、20min，DAB显色, 脱水, 透明, 中性树胶封片, 光学显微镜（OLYMPUS, BX60, Japan）下观察，摄片。1.5 免疫印迹法 取穹窿切断并摘除肾上腺大鼠新鲜下丘脑组织经匀浆、超声粉碎后高速低温离心，11000 r/min，取上清；每例标本提取蛋白50g，7.5SDSPAGE变性凝胶电泳，浓缩胶80V，30min，分离胶120V，90min；转印，40V，95min和100V，120min；TBS浸泡10min，5%脱脂奶粉封闭60min，TTBS中洗25min；CRH一抗(工作浓度11000）中孵育4过夜；HRP标记IgG（工作浓度11500）孵育2h，TTBS洗25min，TBS洗110min，HRPECL法显色, dH2O漂洗，扫描胶片，Scion Image软件分析。1.6 统计学处理 所得实验数据以s表示，用SPSS13.0 软件处理，采用方差分析进行两两比较，以 P<0.05为有统计学意义。2 结果2.1 ELISA检测结果 ELISA结果表明穹窿切断后0、4d，糖皮质激素的浓度无明显变化，7d后糖皮质激素浓度升高，10d升高显著（表1）。表1 各组大鼠血清糖皮质激素的水平(略)2.2 CRH免疫组织化学反应显色结果 正常组及假手术组CRH免疫反应阳性产物呈棕黄色斑块状，主要分布于室旁核神经元的细胞质内。穹窿切断并摘除肾上腺组下丘脑室旁核神经元CRH的阳性表达（0.4990.077）较正常组（0.3870.065）、假手术组（0.3790.082）明显增高，CRH免疫反应的平均光密度值升高，细胞染色变深，（P0.05）（图1）。2.3 免疫印迹法结果 免疫印迹法检测发现下丘脑CRH的表达在穹窿切断并摘除肾上腺组（91.218.73）与假手术组（43.834.16）、正常组（39.723.48）相比明显升高（P0.05）（图2）。3 讨论 CRH是一种重要的神经递质,与机体的内分泌、代谢、心血管功能、神经化学和行为反应密切相关。CRH 广泛表达于中枢神经系统, 但在应激后仅在下丘脑室旁核表达增加6。下丘脑室旁核是HPA轴活动的直接控制部位。应激状态下, 室旁核分泌CRH经正中隆起、垂体门脉系统作用于垂体前叶细胞上高度表达的CRHR1(CRH的I型受体),刺激垂体前叶合成、分泌ACTH,促进肾上腺皮质分泌糖皮质激素，发挥神经内分泌功能7。 研究表明海马对HPA轴有负反馈调节作用。但是从海马到室旁核没有直接的神经投射,间接路径都汇聚到穹窿, 由此可推断海马对HPA轴的调节作用可能是媒介穹窿对下丘脑旁核产生了抑制作用。本课题组的前期实验通过建立大鼠穹窿切断的模型，观察到穹窿切断7d后，CRH的表达升高。提示穹窿切断后, 海马对HPA轴的抑制作用减弱, 室旁核合成CRH 增多, HPA 轴活动增强,证明了海马可能通过穹窿对室旁核发挥抑制作用。但是CRH表达升高，HPA 轴活动增强的最终结果是糖皮质激素的水平升高。为此，本实验在已有的研究基础上建立了大鼠穹窿切断的模型，检测血中糖皮质激素的浓度，实验结果表明穹窿切断7 d后，糖皮质激素的浓度升高，进一步验证了海马通过穹窿对下丘脑室旁核发挥抑制作用。 现将穹窿切断的动物并摘除肾上腺，即在糖皮质激素水平下降的情况下，观察CRH的表达变化。实验结果表明，穹窿切断并摘除肾上腺7d，CRH的表达升高。有研究表明当糖皮质激素的水平过高时，此激素能通过在下丘脑室旁核及其上游水平的调节而有效抑制CRH的释放8。综上结果表明糖皮质激素对CRH有负调节的作用。本实验为探讨海马抑制HPA轴的机制及研究应激的变化机理提供了一定的实验依据。【参考文献】 1 Preil J, Muller MB, Gesing A, et al. Regulation of the hypothalamicpituitaryadrenocortical system in mice deficient for CRH receptors 1 and 2J. Endocrinology, 2001, 142 (11): 49464955.2 Fang H, Hong L, Yanhui Z, et al. Expression of hippocampal corticosteroid receptors, as well as corticotrophinreleasing hormone and vasopressin in the hy pothalamic paraventricular nucleus, in fornix transected ratsJ. Neural Regeneration Rearch，2009，4:325332.3 张彦慧，韩芳，石玉秀.大鼠海马神经元核受体盐皮质激素受体于穹窿切断后表达的变化J. 解剖学杂志，2008，31（4）：522525.4 张彦慧，石玉秀，符皎荣，等.大鼠海马神经元核受体糖皮质激素受体在穹窿切断同时摘除肾上腺后表达的变化J. 神经解剖学杂志，2010，26（2）：161164.5 张彦慧，符皎荣，陆平. 肾上腺切除后大鼠下丘脑室旁核MR、GR表达变化的研究J. 海南医学院学报，2008，14（2）：105107.6 Imaki T, Katsumata H, Miyata M, et al.Expression of corticotrophin releasing hormone type 1 receptor in paraventricular nucleus after acute stressJ.Neuroendocrinology, 2001,73(5):293301.7 Fang Han. Colocalizati