活体细胞溶酶体形态活性荧光染色试剂盒产品说明书中文版.doc

活体细胞溶酶体形态/活性荧光染色试剂盒产品说明书（中文版）主要用途 活体细胞溶酶体形态/活性荧光染色试剂是一种旨在通过长波长的荧光染料特异性地聚集在溶酶体，并呈现红色，用于分析和观察溶酶体形态以及双重染色或重叠染色定位的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种溶酶体（动物、人体、昆虫等）的形态观察、活性探测和定位标记。产品严格无菌，即到即用，活体检测，分辨率高，操作简捷，性能稳定，滞留持久。技术背景溶酶体（lysosome）是一种普遍存在于真核细胞中的细胞器，含有酸性水解酶，例如酯酶、淀粉酶、蛋白酶、核酶等，分解各种细胞残渣和废弃物质，包括过多的或破损的其它细胞器、食物颗粒、吞噬的细菌和病毒等。其大小为0.5至1.5微米，球圆形，溶酶体内pH为5.0左右。溶酶体功能异常会引起溶酶体贮积症（1ysosomal storage disorders；LSDs），例如家族性白痴病（Tay-sachs disease）和庞贝氏症 （Pompes disease）。溶酶体荧光探针LysoTracker RED，是一种向酸性（acidotropic）探针，含有荧光基团在弱碱上，高度选择性地染色酸性细胞器溶酶体。探针自由通过细胞膜，选择性地聚集在溶酶体内。它可以对活细胞进行直接染色，在590nm波长可以清晰看到被染成红色的溶酶体。 产品内容 清理液（Reagent A）毫升 固着液（Reagent B）毫升 染色液（Reagent C）微升 产品说明书1份保存方式保存 染色液（Reagent C）在20冰箱里，避免光照；其余的保存在4冰箱里；有效保证6月用户自备完全细胞培养液：用于染色后培养液更换24孔细胞培养板：用于贴壁细胞染色的容器1.5毫升离心管：用于细胞染色的容器微型台式离心机：用于沉淀细胞培养箱：用于染色孵育（共聚焦）荧光显微镜：用于细胞荧光分析实验步骤 一、 贴壁细胞标准染色1 准备1个细胞培养24孔板的待测细胞，细胞铺满率达70（注意：可以使用载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和其它培养孔板，见注意事项12）2 小心抽去细胞培养液3 小心沿着孔壁加入500微升37预热的用户自备的完全细胞培养液到细胞培养孔，覆盖培养孔表面4 小心加入xx微升 染色液（Reagent C），小心摇动培养板，使其混匀（注意：参见注意事项9和10）5 放进37细胞培养箱里孵育30分钟6 小心抽去含有 染色液（Reagent C）的细胞培养液7 小心沿着孔壁加入1毫升37预热的用户自备的完全细胞培养液到细胞培养孔8 小心抽去完全细胞培养液9 小心沿着孔壁加入1毫升37预热的用户自备的完全细胞培养液到细胞培养孔10 即刻在倒置荧光显微镜下进行观察：激发波长577nm，散发波长590nm（溶酶体呈现红色）二、 贴壁细胞快速染色1 准备1个细胞培养24孔板的待测细胞，细胞铺满率达70（注意：可以使用载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和其它培养孔板，见注意事项12）2 直接加入xx微升（1：500容量比） 染色液（Reagent C）到1毫升培养液里，小心摇动培养板，使其混匀（注意：参见注意事项9和10）3 放进37细胞培养箱里孵育30分钟4 小心抽去含有 染色液（Reagent C）的细胞培养液5 小心沿着孔壁加入1毫升37预热的用户自备的完全细胞培养液到细胞培养孔6 即刻在倒置荧光显微镜下进行观察：激发波长577nm，散发波长590nm（溶酶体呈现红色）三、 悬浮细胞或脱离细胞染色1 将悬浮细胞或脱离细胞（1 X 106细胞）移入到1.5毫升离心管2 放进微型台式离心机离心1分钟，速度为300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）3 小心抽去上清液4 加入500微升37预热的用户自备的完全细胞培养液5 加入xx微升 染色液（Reagent C），充分混匀（注意：参见注意事项9和10）6 放进37细胞培养箱里孵育30分钟7 放进微型台式离心机离心1分钟，速度为300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）8 加入500微升37预热的用户自备的完全细胞培养液，混匀9 放进微型台式离心机离心1分钟，速度为300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）10 小心抽去完全细胞培养液11 移出5微升到载玻片上，放上盖玻片12 （选择步骤）如果需要双重染色，移出3.5微升染色细胞到载玻片上13 （选择步骤）加入1微升用户需测的第二染料，放上盖玻片14 （选择步骤）放进37细胞培养箱里孵育10分钟15 即刻在（共聚焦）荧光显微镜下进行观察：激发波长577nm，散发波长590nm（溶酶体呈现红色）四、细胞双重染色1 准备1个载玻片培养皿的待测细胞2 小心抽去细胞培养液3 小心加入1毫升37预热的用户自备的完全细胞培养液4 小心加入xx微升 染色液（Reagent C），小心摇动培养皿，使其混匀（注意：参见注意事项9和10）5 放进37细胞培养箱里孵育30分钟6 小心抽去含有 染色液（Reagent C）的细胞培养液7 小心加入xx微升37预热的 清理液（Reagent A）8 小心抽去 清理液（Reagent A）（注意：由此步骤开始，用户可以进行其它膜通透性荧光染料的标记;如果是膜不通透性荧光染料，继续下列操作）9 小心加入xx微升37预热的 清理液（Reagent A）10 小心加入xx微升 固着液（Reagent B），小心摇动培养皿，使其混匀11 放进37细胞培养箱里孵育15分钟12 小心抽去含有 固着液（Reagent B）的 清理液（Reagent A）13 小心加入xx毫升37预热的 清理液（Reagent A）14 小心抽去 清理液（Reagent A）（注意：由此步骤开始，用户可以进行抗体荧光染色或膜不通透性荧光染料的通透和标记）15 在荧光显微镜下进行观察五、 细胞固定染色1准备1个细胞培养24孔板的待测细胞，细胞铺满率达70（注意：可以使用载玻片，载玻片培养皿，35mm培养皿，和其它培养孔板，见注意事项12）2 小心抽去细胞培养液3 小心沿着孔壁加入500微升37预热的用户自备的完全细胞培养液到细胞培养孔，覆盖培养孔表面4 小心加入5xx微升 固着液（Reagent B），小心摇动培养板，使其混匀5 放进37细胞培养箱里孵育15分钟6 小心抽去含有 固着液（Reagent B）的细胞培养液7 小心加入xx微升 清理液（Reagent A）8 小心抽去 清理液（Reagent A）9 再加入xx微升 清理液（Reagent A）10 小心加入xx微升 染色液（Reagent C），小心摇动培养板，使其混匀（注意：参见注意事项10）11 放进37细胞培养箱里孵育30分钟12 小心抽去含有 染色液（Reagent C）的 清理液（Reagent A）13 加入xx微升新鲜的 清理液（Reagent A）14 小心抽去 清理液（Reagent A）15 再加入xx微升 清理液（Reagent A）16 即刻在倒置荧光显微镜下进行观察：激发波长577nm，散发波长590nm（溶酶体呈现红色）六、 切片染色1 准备1个待测的切片样品2 小心加上xx微升 清理液（Reagent A），覆盖切片表面3 小心移去切片上的 清理液（Reagent A）4 小心加上xx微升 清理液（Reagent A），覆盖切片表面5 小心加入xx微升 固着液（Reagent B）6 室温下孵育10分钟7 小心移去切片上的 固着液（Reagent B）8 小心加上xx微升 清理液（Reagent A），覆盖切片表面9 小心移去切片上的 清理液（Reagent A）10 移取xx微升 清理液（Reagent A）到新的1.5毫升离心管11 加入xx微升 染色液（Reagent C），混匀（注意：参见注意事项10）12 小心加上上述 染色液（Reagent C）到切片上，覆盖切片表面13 放进37细胞培养箱里孵育30分钟14 小心移去切片上的 染色液（Reagent C）15 小心加上xx微升新鲜的 清理液（Reagent A）16 小心移去 清理液（Reagent A）17 盖上盖玻片18 即刻在荧光显微镜下进行观察：激发波长577nm，散发波长590nm（溶酶体呈现红色）注意事项1 本产品为20次（1毫升体系）和40次（500微升体系）操作2 操作时，避免污染母液3 操作时，须戴手套4 染色前，所有试剂溶液（除 染色液外）需37预热5 建议细胞染色完成后，即刻进行荧光检测分析 6 孵育时，必须避免光照7 剩余的染色工作液可放进20储存备用8 本产品适合活体染色和固定染色，染色剂不易洗掉，染色持久9 活细胞染色：1毫升体系可以使用1微升（1：1000容量比） 染色液（Reagent C） 10 根据不同细胞类型，调整 染色液（Reagent C）的使用剂量（1：100至1：1000容量比），避免过度染色11 如果染色不明显，可以延长孵育时间至2小时12 本产品友好使用于双重染色或重叠染色13