高效液相色谱法讲义

第二十章 高效液相色谱法,High-Performance Liquid Chromatography,优点,高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离 高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV10-9g, 荧光检测器 10-12g,High-Performance Liquid Chromatography,HPLC与GC的比较,分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。,High-Performance Liquid Chromatography,第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理,一、主要类型,化学键合相色谱法（Bonded phase chromatography, BPC) 离子抑制色谱法（Ion suppression chromatography, ISC) 离子对色谱法（Paired ion chromatography, PIC) 亲合色谱法（Affinity chromatography, AC) 手性色谱法（Chiral chromatography, CC) 胶束色谱法（Micellar chromatography, MC) 电色谱法（Electrochromatography, EC),High-Performance Liquid Chromatography,二、化学键合相色谱法,化学键合相：采用化学反应的方法将固定液键合在载体表面上，所形成的填料 化学键合相色谱法：以化学键合相为固定相的色谱法,High-Performance Liquid Chromatography,疏溶剂理论,溶质分子的非极性部分与固定相上的烃基之间产生疏溶剂缔合作用 溶质的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开烃基，即解缔合作用,High-Performance Liquid Chromatography,影响溶质在反相键合相上保留行为的主要因素,溶质的分子结构,流动相,固定相,溶质极性 ，k ，tR 溶质极性 ，k ，tR,表面张力 ，k ，tR 介电常数 ，k ，tR 离解程度 ，k ，tR,键合烷基链 ，疏水性 ，k,High-Performance Liquid Chromatography,0,0,0,0,High-Performance Liquid Chromatography,High-Performance Liquid Chromatography,反相离子对色谱,原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为对离子或反离子）加入到含水流动相中，使待测离子A与对离子B形成离子对AB，该AB离子对的性质与A离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性。,由于离子对AB具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待测离子A1，A2，A3因与B离子间的成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目的。,High-Performance Liquid Chromatography,影响保留因子的因素,一、离子对试剂的种类和浓度,酸类或带负电荷物质四丁基季铵盐 碱类或带正电荷物质烷基磺酸盐或硫酸盐,High-Performance Liquid Chromatography,二、流动相的pH值 尽量使得试样组分与离子对试剂全部离子化。 pH值对弱酸和弱碱的保留有很大的影响。,离子对色谱法适用于有机酸、碱、盐的分离，以及用离子交换色谱法无法分离的离子型和非离子型化合物的混合物分离。如生物碱类、儿茶酚胺类、有机酸类、维生素类和抗生素类药物。,High-Performance Liquid Chromatography,手性色谱法,Chiral Chromatography,High-Performance Liquid Chromatography,布洛芬,SIbuprofen,RIbuprofen,美国、日本等国的药品管理部门已要求在申请新手性药物时，提供每一种对映体的药动学、药理学和毒理学研究资料，并对研制外消旋体而不是单个对映体作出合理的解释。,High-Performance Liquid Chromatography,手性固定相法 手性衍生化法 手性流动相添加剂法,High-Performance Liquid Chromatography,High-Performance Liquid Chromatography,R-Isomer,Zolmitriptan,Column: Chiralpak AD-H Mobile phase: Hexane/Isopropanol/Triethylamine 72/28/0.25, V/V/V,Yu L.S. et al., (2005) Biomedical Chromatography, 19, 191-195.,*,*,*,S/R=2.6,S/R=2.7,S/R=3.1,High-Performance Liquid Chromatography,第二节 高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择,一、化学键合相色谱法的固定相 1. 键合相的种类,非极性键合相,弱极性键合相,极性键合相,C1,C8,C18,苯基,较少应用,反相色谱,氨基 氰基,正相色谱,High-Performance Liquid Chromatography,2. 键合相的性质和特点,键合反应,含碳量和覆盖度,代表键合相表面基团的键合量，其值越高说明载体上的硅醇基被键合的越完全，固定相吸附性能降低，稳定性增加。,特点,a 使用过程中不流失；b 化学稳定性好；c 适于梯度洗脱；d 载样量大,使用注意点,流动相中水相的pH应维持在28，否则会引起硅胶溶解 不同厂家，不同批号的同一类型键合相也可能表现不同的色谱特性,High-Performance Liquid Chromatography,二、化学键合相色谱法的流动相,根据溶剂的极性和强度来选择,High-Performance Liquid Chromatography,三、分离条件的选择,高效液相色谱中的速率理论,H = A +Cmu + Csmu,涡流扩散,流动相传质阻抗,静态流动相传质阻抗,粒度,根据速率理论，HPLC的实验条件应该是：,小粒度，均匀的球形化学键合相 低粘度流动相，流速不宜快 柱温适当,High-Performance Liquid Chromatography,固定相颗粒对色谱分离的影响,High-Performance Liquid Chromatography,High-Performance Liquid Chromatography,High-Performance Liquid Chromatography,正相键合相色谱法的分离条件,通常采用烷烃加适量极性调节剂,反相键合相色谱法的分离条件,一般以极性最强的水为基础溶剂，加入甲醇、乙腈等极性调节剂,反相离子对色谱法的分离条件,离子对试剂的选择 流动相pH的选择 有机溶剂及其浓度的选择,High-Performance Liquid Chromatography,第三节 高效液相色谱仪,High-Performance Liquid Chromatography,一、输液系统,等强度洗脱 梯度洗脱,High-Performance Liquid Chromatography,二、分离和进样系统,High-Performance Liquid Chromatography,三、检测系统,对检测器的要求：,灵敏度高,噪音低,线性范围宽,重复性好,适用范围广,High-Performance Liquid Chromatography,PDAD,紫外检测器,适用于具有紫外吸收的组分,High-Performance Liquid Chromatography,蒸发光散射检测器,适用于糖类、高级脂肪酸、氨基酸、甘油三酯等,High-Performance Liquid Chromatography,安培检测器,适合于具有氧化还原活性的物质，如生物胺，酚、羰基、巯基化合物,High-Performance Liquid Chromatography,化学发光检测器,双（2，4，6）三氯苯基草酸酯,High-Performance Liquid Chromatography,四、控制/记录系统,High-Performance Liquid Chromatography,第四节 高效液相色谱分析方法,一、定性分析方法,二、定量分析方法,1. 外标法,外标一点法,A标,A样,C标V,C样V,标准曲线法,A = a + bC,High-Performance Liquid Chromatography,2. 内标法,以待测组分和内标物的峰高比或峰面积比求算试样含量的方法。 使用内标法可以抵消仪器稳定性差、进样量不够准确等原因带来的定量分析误差。,