人脐血间充质干细胞抑制异体T淋巴细胞反应的实验及临床意义.docVIP

人脐血间充质干细胞抑制异体T淋巴细胞反应的实验及临床意义 作者：王茜，杨琨，白海， 吴涛， 路继红 【摘要】 目的： 研究人脐血间充质干细胞(MSCs)对异体外周血T淋巴细胞抑制的影响. 方法：分离、扩增脐血MSCs，流式细胞术检测表面标志以鉴定. 取分离培养的脐血MSCs，与经分离的异体淋巴细胞共培养，在植物血凝素（PHA）刺激下，用MTT还原法测定细胞增殖，观察脐血MSCs对PHA刺激的T淋巴细胞转化抑制作用. 采用ELISA检测培养上清中IFN和IL4的分泌水平. 结果：脐血MSCs在PHA刺激下可抑制T淋巴细胞增殖，且其培养上清也具有抑制异体淋巴细胞增殖转化能力. ELISA检测7 d共培养上清中IFN和IL4两种细胞因子的含量，发现IFN分泌水平下调、IL4分泌水平部分上调. 结论：脐血MSCs具有抑制异体淋巴细胞免疫反应，降低移植物抗宿主反应（GVHD）的作用. 具有研究价值和应用潜能. 【关键词】 胎血/细胞学;间质干细胞；外周血T淋巴细胞；植物血凝素类；干扰素型；白细胞介素4 【Abstract】 AIM: To study the effects of human umbilical cord bloodderived mesenchymal stem cells (MSCs) on peripheral blood T lymphocytes. METHODS: MSCs were isolated from normal human umbilical cord blood, cultured in vitro, purified and then identified by examining surface marker with FCM. Lymphocytes were isolated from allogenic peripheral blood and identified with FCM. The MSCs and lymphocytes were cocultured in 96well plates for 72 h. T lymphocyte proliferation was measured by using MTT reduction method and the effect of MSCs on the T lymphocyte transformation stimulated by PHA was observed. On day 7 of coculture, the culture supernatant was collected to detect the expressions of IFN and IL4 with ELISA. RESULTS: Human umbilical cord bloodderived MSCs inhibited T lymphocyte proliferation and PHA induced lymphocyte transformation. The secretion of IFN in supernatant was significantly downregulated,while the expression of IL4 was partially increased. CONCLUSION: Human umbilical cord bloodderived MSCs can inhibit the immune response of allogenic T lymphocytes and alleviate the grafeversushost diseases. 【Keywords】 fetal blood/cytology; mesenchymal stem cells; peripheral blood Tlymphocytes; phytohemagglutinins; interferon Type; interleukin 4; 0 引言 间充质干细胞(mesenchymalstem cell, MSCs) 成为目前倍受关注的一类多能干细胞. 人脐血中除含有丰富的造血干细胞，还存在一类不同于造血干细胞的原始细胞，在合适的条件下可以向成骨细胞和脂肪细胞分化，甚至跨系向神经元细胞分化1，表现出较强的多向分化潜能. 脐血MSCs可从脐血、胎盘、羊水、脐静脉内皮下层、外周等组织中分离2-3，与骨髓MSCs相比，脐血MSCs具有来源丰富、取材方便、移植排斥反应轻微和外源性污染少等优点，因而具有更大的研究价值和应用潜能. MSCs除具有支持体外造血、促进体内造血重建功能外，还具有抑制同种异体免疫反应，降低移植物抗宿主反应的作用. 体内实验表明，器官移植时输注MSCs可减轻排斥反应和延长移植物生存时间. 我们试图通过研究人脐血MSCs对异体外周血T淋巴细胞的影响，进一步探讨MSCs的免疫调控机制，为脐血MSCs的应用提供实验依据. 1材料和方法 1.1材料 RPMI1640培养基(华美公司)；淋巴细胞分离液（华美公司）；抗CD13，CD44，CD71，CD166，CD34，CD45，CD3，CD4，CD8荧光抗体（晶美公司）. 1.2方法 1.2.1脐血MSCs的分离和培养无菌条件 取脐带血30 mL，肝素抗凝. 用PBS平衡盐溶液稀释混匀，Percoll淋巴细胞分离液1500 r/min离心20 min，吸取界面单个核细胞，LGDMEM培养液，1000 r/min离心3 min，洗涤2次. 显微镜下记数，按1106/cm2密度分别接种于25T塑料培养瓶，37, 5 mL/L CO2孵箱中培养48 h. 更换培养液，弃去未贴壁的细胞，每3 d半量换液1次. 待细胞达到80%90%融合，消化、记数. 然后进行传代接种培养，记为P1代. 再传代培养记为P2代，取P3P5代进行实验. 1.2.2细胞表面分子测定 取密度为1109/L单细胞悬液，与抗CD13, CD44, CD71, CD166, CD34, CD45荧光标记抗体室温反应30 min，洗涤、固定，流式细胞仪检测. 1.2.3外周血T淋巴细胞分离、鉴定 取肝素抗凝新鲜外周血用PBS倍比稀释后，用淋巴细胞分离液(Ficoll，1.077 g/L)分离外周血单个核细胞（PBMC），PBS洗涤2次. 计数后以含200 mL/L FBS的RPMI1640培养基悬浮，调整细胞密度为81010/L，将细胞悬液加入自制尼龙棉柱内，平置于37温箱中孵育1 h，用预温至37的上述培养基冲洗出非黏附细胞即为淋巴细胞. 洗下的悬液离心后重悬于上述培养基中并调整细胞密度至1109/L. 取1109/L个细胞用PBS洗涤2次后与抗CD3, CD4, CD8荧光标记抗体室温闭光反应30 min，洗涤、固定，用流式细胞仪检测. 1.2.4脐血MSCs对异体淋巴细胞的影响 脐血MSCs消化、洗涤、计数后，调整细胞密度为1l09/L接种于96孔培养板，每孔100 L，待其贴壁后，以5 L/孔丝裂霉素处理. 在相应组加入淋巴细胞悬液及植物血凝素（PHA） 5 L以刺激淋巴细胞转化. 实验分组，A: 淋巴细胞组；B: MSCs+淋巴细胞组：C: MSCs+淋巴细胞+PHA组； D: 淋巴细胞+PHA组. 37, 5 mL/L CO2孵箱中培养72 h后，加入MTT 20 L/孔. 继续孵育4 h，300 r/min离心10 min，弃去孔内培养液. 每孔加入150 L DMSO，振荡10 min，酶标仪490 nm处读数，抑制T淋巴细胞增殖. 淋巴细胞增殖抑制率(%)=1-（C-B）/（D-A）100%. 1.2.5脐血MSCs培养 上清对异体淋巴细胞的影响收集已培养3 d的脐血MSCs培养上清，置于96孔培养板，每孔100 L. 在相应组加入分离的外周血淋巴细胞悬液100 L及PHA以刺激淋巴细胞转化. 实验分组，A: 培养上清+淋巴细胞组；B: 培养上清+淋巴细胞+PHA组；C: 淋巴细胞组；D: 淋巴细胞+PHA组. 其他同方法1.4. 正常淋巴细胞增殖抑制率(%)=（C-A）/C100%；PHA刺激下淋巴细胞增殖抑制率(%)=（D-B）/D100%. 1.2.6ELISA定量检测 培养上清中IFN和IL4的含量实验步骤按照ELISA检测试剂盒（晶美公司）操作说明进行. 实验组分为： 单独MSCs组； MSCs+淋巴细胞组；单独淋巴细胞组（对照组）. 37, 50 mL/L CO2孵箱中培养7 d，取培养上清作IFN和IL4分泌水平的ELISA检测. 统计学处理: 用SPSS 11.5统计软件对实验结果进行方差分析及两两比较.P<0.05认为差异有统计学意义. 2结果 2.1脐血MSCs培养及鉴定原代培养4872 h后出现贴壁的间充质样细胞，为成纤维样的长梭形细胞. 当细胞生长达80%90%融合，细胞呈辐射状生长，为脐血源性的MSCs(图1). 流式细胞仪检测结果显示90%细胞稳定地表达CD44, CD71, 相关抗原标记，但不表达造血细胞系的表面标记CD45(图2)，这与源于骨髓MSCs的表面抗原标记相一致. 2.2外周血淋巴细胞分离、鉴定分离后的淋巴细胞，经流式细胞仪检测T细胞所占比例可达70%82%. 2.3脐血MSCs对异体淋巴细胞增殖的影响与脐血MSCs共同培养的异体淋巴细胞组与未共同培养组相比，淋巴细胞增殖活性下降，其增殖转化抑制率为56.58%，两者差异具有统计学意义（P<0.01）. 2.4脐血MSCs培养上清对异体淋巴细胞增殖的影响与脐血MSCs培养上清共同培养后的异体淋巴细胞组与未共同培养组相比较，细胞增殖活性明显下降，两者有统计学意义（P<0.05），其增殖转化抑制率为9.04%. 在有PHA刺激淋巴细胞增殖的情况下，细胞活性进一步下降，两者有统计学意义（P<0.01），其增殖转化抑制率达20.47%. 2.5培养上清IFN和IL4分泌水平的ELISA检测脐血MSCs与淋巴细胞共培养7 d，培养上清中IFN分泌水平较单独淋巴细胞组（27.462.56 vs 58.038.55）下降（P<0.01）；IL4分泌水平( 1.540.13 vs 0.150.09) 则上调（P<0.01）. 3讨论 目前,对于脐血MSCs的存在及能否传代扩增,仍有较大争议4. 而其在体外培养过程中,由于生长周期相对缓慢、原代细胞培养时间较长，成为制约脐血MSCs应用的障碍. 本实验旨在建立和完善脐血MSCs体外分离、培养、扩增体系,观察脐血MSCs对PHA刺激外周血T淋巴细胞抑制作用的影响，为探讨脐血MSCs免疫调节能力提供实验依据. 已知脐血MSCs可分泌一些细胞因子，并通过自分泌或旁分泌形式发挥效应5. 我们的实验发现，在PHA刺激下，与脐血MSCs共同培养的异体淋巴细胞组与未共同培养组比较，淋巴细胞增殖活性明显下降，其增殖转化抑制率为56.58%. 脐血MSCs究竟是通过细胞间接触直接发挥免疫抑制作用还是通过分泌某些细胞因子而间接对淋巴细胞起抑制作用？为进一步探讨脐血MSCs免疫负调控的作用机制，我们又观察了脐血MSCs培养上清对异体淋巴细胞增殖的影响. 实验结果表明：在无细胞直接接触的情况下，单纯脐血MSCs培养上清对异体淋巴细胞增殖也表现出负调控效应，且此种效应在PHA对淋巴细胞刺激时有所增强（20.47% vs 9.04%），但均较脐血MSCs与淋巴细胞共培养后所表现出的负调控效应（56.58%）低. 本实验结果提示：细胞间的直接接触在脐血MSCs的免疫负调控机制中起主要作用，但分泌的可溶性细胞因子也间接对淋巴细胞发挥抑制作用，且在外源性丝裂原刺激存在的情况下，其抑制作用明显增强. Th细胞根据分泌细胞因子的种类不同主要分为Th1和Th26，而IFN和IL4是促进CD4+T细胞分别向Th1和Th2分化的主要细胞因子. 由于Th1主要分泌IL2, IFN和IFN，而Th2主要分泌IL2, IL4和IL10，因此Th1细胞可能诱发GVHD，而Th2细胞不会诱发GVHD，并可能对未经处理T细胞所引起的GVHD具有调节作用,发挥GVL效应7. 故Th1和Th2细胞分泌的细胞因子失衡可能是造成GVHD组织损伤的重要原因之一. Aggarwal等8发现骨髓MSCs具有抑制Th1分泌IFN,增加Th2细胞分泌IL4的能力. 据此推测，骨髓MSCs在下调炎症因子释放的Th1细胞比例、上调抗炎作用的Th2细胞比例的同时，抑制体内巨噬细胞分泌IFN,并伴有CLT，NK和LAK细胞功能的降低，减轻由此介导的一系列组织损伤作用，从而降低GVHD的严重程度. 由于脐血MSCs较骨髓MSCs有诸多优越性，如更为原始、分化能力强，因此可能在临床移植应用中使GVHD的发生率更低. 我们通过ELASA定量检测培养上清中细胞因子IFN和IL4的含量发现，单独脐血MSCs培养上清中IFN低表达或不表达，且IL4的表达较单独外周血淋巴细胞的要高；当脐血MSCs与淋巴细胞共培养时，可显著下调IFN的分泌水平、上调IL4的分泌水平. 此结果类似于骨髓MSCs，与习杰英等9报道脐血单个核细胞所分泌细胞因子相符. 由此可见，脐血MSCs极具临床应用潜力，在移植过程中可预防和治疗allHSCT术后GVHD的发生，减少移植发病率和死亡率，从而提高受者生活质量和长期存活率. 【参考文献】 1侯玲玲，曹华，裴雪涛，等. 人脐血MSC 体外扩增和向神经元样细胞定向诱导分化的研究J. 中华血液学杂志，2002, 23：415-419. 2Gang EJ, Hong SH, Jeong JA, et al. In vitro mesengenic potential of human umbilical cord bloodderived mesenchymal stem cellsJ. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 321(1): 102-108. 3Yen BL, Huang HI, Chien CC, et al. Isolation of mulipotent cells from human term placentaJ. Stem Cells, 2005, 23(1): 3-9. 4Wexler SA, Donaldson C, DenningKendall P, et al. Adult bonemarrow is a rich source of human mesenchymal stem cells but umbilical co