梗阻性黄疸大鼠肝脏损害及血清毒性物质变化.doc

梗阻性黄疸大鼠肝脏损害及血清毒性物质变化 作者：韩德兰 苑建斌 王永清 闫秀玲【摘要】 目的:探讨梗阻性黄疸(梗黄)大鼠肝脏损害及其血清毒性物质的变化。方法:采用胆总管结扎方法建立梗阻性黄疸大鼠模型，将36只大鼠随机分为假手术(sham)组6只、梗阻性黄疸(CBDL)组30只(CBDL组又分为1周、2周、3周、4周、5周亚组,每组6只)。监测各组血液TNF、内毒素、肝功能变化。结果：CBDL组均可见肝细胞坏死及增生，汇管区可见胆管扩张、胆汁淤积，肝组织改变随梗阻时间的延长而逐渐加重，血清内毒素及TNF含量与梗阻时间明显相关。结论：CBDL大鼠肝脏形态改变明显，血ALT、TBIL、内毒素、TNF含量明显升高，并与梗黄时间有关。 【关键词】 大鼠;黄疸/阻塞性;肝脏;肿瘤坏死因子【ABSTRACT】 Objective:To study the liver damage and toxicity index variation in serum for obstructive jaundice rats.Methods:Choledoch ligation method was used to establish obstruction jaundice rat model,while 36 models were divided into sham group with 6 mice，and CBDL group 30，30 models in CBDL group were subdivided into.1week、2week、3week、4week、5week，per 6 groups.The blood TNF，endotoxin，liver function were detected.Results:For the rats in CBDL group,liver shape changed obviously,and blood ALT，TBIL，the endotoxin，TNF contents increased evidently,concerning with time of OJ.Conclusion:Microscope examination showed that liver cell necrosis was heavy in rats of CBDL group，bile was filled up in bile duck in rats of both group，and the liver organization was damaged along with the obstruction time extension，but was aggravated gradually.The blood endotoxin and TNF content were obviously related with obstruction time.【KEY WORDS】 Rats,Jaundice/Obstructive,Liver,Tumor necrosis factor梗阻性黄疸(obstructive jaundice，OJ)是多种肝胆疾病的共同病理过程，具有死亡率高、并发症多的临床特点，目前普遍认为与内毒素(ETX)有关12。而肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)在内毒素血症(endotoxemia,ETM)中起关键作用 1。本研究通过观察OJ大鼠模型2周肝脏形态学改变、不同时间肝功能指标及内毒素、TNF浓度变化，以期发现其变化规律，为临床研究和治疗提供可靠依据。1 材料与方法1.1 实验动物 按照GB1492294实验动物微生物和寄生虫检测等级的标准，选用同一实验室清洁级成年健康雄性SpragueDawley大鼠36只，体重(25025)g。由河北医科大学实验动物中心提供(合格证编号：807145)。1.2 主要仪器、制剂 德国Bayer公司3600020自动生化分析仪;日本Olympus公司CHK2FGS显微镜;日本Hitach公司80P7超速低温离心机;德国Walldorf公司HM315组织切片机;北京普尔伟业生物科技公司TNF放免试剂盒;北京安度斯生物技术公司的鲎试剂盒等。1.3 方法1.3.1 实验动物模型的建立 对大鼠采用胆总管结扎的方法建立梗阻性黄疸大鼠模型(CBDL组)3。具体操作方法如下：采用10%水合氯醛按 3mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。在无菌条件下行腹腔正中线切口，切口长约2cm，至剑突下，暴露十二指肠上段胆总管，近肝门处分离肝门静脉与胆总管，剥离胆总管周围组织。用3/0号丝线双重结扎胆总管，与两道结扎线之间切断胆总管，分层关腹。假手术组(sham 组)动物游离胆总管步骤与前相同，但只置线不结扎。整个操作均在无菌条件下进行，然后饲以正常饮水及复合饲料喂养。模型建立组分别于结扎后1、2、3、4、5周麻醉动物取材(每个取材时间点6只)，假手术组6只与5周模型组同批麻醉取材。1.3.2 取材 以10%水合氯醛(3mL/kg)腹腔内注射麻醉大鼠，切开皮肤暴露腹腔，心脏取血，留取血液。血标本静置1h后，以3 000r/min低温离心15min，取血清-20冻存，用于TNF、ETX、肝功能检测。留取肝组织，采用HE染色确定模型建立情况，Masson三色染色观察肝硬化形成情况，石蜡包埋的肝组织以4m的厚度连续切片，按以下步骤进行Masson三色染色：二甲苯脱蜡梯度酒精至水-0.5%苏木素7min1%盐酸酒精分化4s酸性丽春红品红15min1%磷鉬酸10s2%苯胺蓝2min0.2%冰醋酸1min梯度酒精至水二甲苯透明中性树胶封片。1.3.3 血清肝功能检测 从-20冰箱中取出血清样本，于37水浴箱中水浴10min，采用全自动血清生化分析仪，由生化室协助测定血清总胆红素(TBIL)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)值。1.3.4 血清TNF的测定 取血清样本严格按照大鼠放射免疫试剂盒说明书要求检测细胞因子TNF水平。1.3.5 ETX测定 在一定条件下，极微量的ETX能把终点法鲎试剂(TAL)中的凝固酶原激活为凝固酶，凝固酶能迅速催化人工合成的显色底物分裂出显色基团pNA(对硝基苯胺)，游离的pNA在溶液中呈黄色，可用分光光度计在405410mm处测定溶液的吸光度值A。1.4 统计学处理 采用SPSS12.0软件包，数据均用均数准差(xs)表示，进行方差检验，P<0.05为差异有显著性。2 结果2.1 活体观察动物模型均成功建立。sham 组大鼠活动灵敏，毛发光滑，大便黑硬，小便淡黄。CBDL组动物于手术1周可见耳部等皮肤较薄的部位黄染，尿色转为深黄，之后出现食欲不振，精神萎靡，毛发蓬松，黄染，大便苍白，小便黄，5周末时动物体形消瘦、腹部膨隆、步态不稳。2.2 大鼠肝组织病理变化HE、Masson三色染色显示，sham组：HE染色肝小叶结构完整，肝板排列整齐(图1);Masson三色染色仅在门管区可见少量结缔组织(图2)。CBDL组：造模2周门管区小胆管广泛增生，胆管扩张，其上皮呈低柱状或立方形，增生的小胆管周围有纤维组织增生，门管区所占面积扩大，肝小叶内也有纤维组织增生(图3、4)。图1 假手术组(HE100)图2 假手术组(Masson400)图3 模型建立组(HE100)图4 模型建立组(Masson400)2.3 血清各指标检测结果2.3.1 肝功能变化 血清ALT在CBDL术后造模组1周即明显增加，与Sham组比较有明显差异(P<0.05)，之后逐渐下降，但均明显高于Sham组。血清TBIL趋势与ALT相同。2.3.2 ETX及TNF变化 ETX检测结果：CBDL术后造模组1周血浆内毒素水平即明显升高，与Sham组比较差异有显著性(P<0.05)。3周时有所下降，但仍显著高于Sham组。5周时又回升至术后1周水平;TNF检测结果：CBDL术后造模组1周血清TNF水平即明显升高，与Sham组比较差异有显著性(P<0.05)，之后呈上升趋势，3周时血清TNF水平达高峰，4周时有所回落，5周有所回升，但均明显高于Sham组(见表1、表2)。表1 两组TBIL和ALT水平变化注：与Sham组相比*P<0.05表2 两组ETX、TNF水平变化注：与Sham组相比*P<0.053 讨论梗阻性黄疸是一种常见病，其术后并发症和死亡率较高，其主要原因是内毒素血症和多脏器损害2。ETX对OJ大鼠肝脏有强烈的损伤作用，而它的病理生理作用主要由TNF所介导4。TNF是一种细胞因子，是由单核巨噬细胞、T细胞、肥大细胞等产生，适量时可发挥免疫调节作用，分泌过多时，则参与机体的多种病理生理改变，甚至造成多器官损伤2。本次实验结果显示CBDL组血浆ETX、TNF水平先升高，之后下降，后又回升趋势，可能是由于血液中梗阻性黄疸初期肠道内胆盐的减少、细菌的异常繁殖及肠道黏膜的缺血缺氧可造成肠源性ETX大量进入血液，ETX刺激枯否细胞产生的TNF也增多并逐渐达到高峰，但随着梗阻时间的延长，肠道黏膜的免疫屏障功能保护性增强，进入血液的ETX量减少，且肾脏在 NO 作用下排除一定量的ETX，之后由于肠系膜血流增加，门脉压升高，进入肝脏的血流增加，ETX增加，从而产生的TNF也随之增加5。统计学结果表明，血清TNF值与Sham组比较差异有显著性。与姜宪等6的研究结果一致。ETX和TNF随时间改变的同时肝脏损害亦随梗阻时间的延长而逐渐加重，这与杨光等的血清TNF参与了梗阻性黄疸时肝的损害，并与肝功能的损害程度正相关4结论相似。本研究探讨了梗阻性黄疸大鼠肝损害与ETX、TNF等随时间改变的规律，期望为梗阻性黄疸肝损害的临床研究和治疗提供一定的理论基础。【参考文献】 1 Cagl IK,Besirov E,Ozkan H，et al.The effect of granulocyte colony stimulating factor on the immune parameters in experimental obstructive jaundiceJ.Hepatogastroenterology,2001,48(37):220 223.2 李端阳.肿瘤坏死因子与梗阻性黄疸J.临床肝病杂志,1999，8(15)：138141.3 徐锋.梗阻性黄疸下大鼠肝缺血再灌注损伤肝细胞死亡方式及其防护研究D.沈阳：中国医科大学，2006.4 杨光.梗阻性黄疸时TNF对大鼠肝、肾的影响J.哈尔滨医科大学学报,2003,37(2):143146.5Scopa CD,Koureleas S,Tsamandas AC，et al.Beneficial effects o