硫化氢在脂多糖所致老年大鼠急性肺损伤中的作用.doc

硫化氢在脂多糖所致老年大鼠急性肺损伤中的作用 作者：周晓红 黄新莉 曹华 张雪静 凌亦凌【摘要】 目的 探讨硫化氢（H2S）在脂多糖（LPS）所致老年大鼠急性肺损伤（ALI）中的作用机制。方法 64只SD老年大鼠随机分为对照组、LPS组、NaHS+LPS组、炔丙基甘氨酸（PPG）+LPS组，每组16只。LPS组、NaHS+LPS组、PPG+LPS组经气管内滴注LPS 200 g/只，制备大鼠ALI模型；对照组经气管内滴注无菌生理盐水200 l/只。NaHS+LPS组制模前10 min腹腔注射NaHS 28 mol/kg，PPG+LPS组制模前10 min腹腔注射PPG 45 mg/kg。给药后4 h或8 h处死动物，测定肺系数；光镜观察肺组织形态学改变；化学法检测血浆H2S、NO和CO含量、肺组织丙二醛（MDA）含量、胱硫醚裂解酶（CSE）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和血红素加氧酶1（HO1）活性；采用免疫组织化学法检测肺组织iNOS、HO1蛋白表达及吸光度值。结果 气管内滴注LPS可引起肺组织明显的形态学改变；肺系数和肺组织MDA含量增加；血浆H2S含量和肺组织CSE活性下降；肺组织iNOS活性和iNOS蛋白表达增强，血浆NO含量增加；肺组织HO活性和HO1蛋白表达增强，血浆CO含量增加。预先给予NaHS可显著减轻LPS所致肺组织损伤，肺系数和肺组织MDA含量下降；血浆H2S含量和肺组织CSE活性升高；肺组织iNOS活性和iNOS蛋白表达减弱，血浆NO含量减少；肺组织HO活性和HO1蛋白表达增强，血浆CO含量增加（均P0.05）。而预先给予PPG可加重LPS所致肺损伤，使血浆NO含量、肺组织iNOS活性和iNOS蛋白表达进一步增加（均P0.05），但对血浆CO含量、HO活性和HO1蛋白表达无明显影响。结论 H2S/CSE体系的下调在LPS所致老年大鼠ALI的发病学中有一定作用，而外源性给予一定量的NaHS对肺组织具有保护作用，其可能与抗氧化效应和下调NO/iNOS体系、上调CO/HO1体系有一定关系。 【关键词】 硫化氢；老年大鼠；急性肺损伤；一氧化氮；一氧化碳；一氧化氮合酶；血红素加氧酶急性肺损伤（acute lung injury，ALI）主要病变特点是急性弥漫性肺泡和肺血管损伤，最终可发展至急性呼吸窘迫综合征，其发病机制尚未完全阐明。内源性气体信号分子NO和CO在ALI中的作用已得到证实13，研究表明H2S可能是继NO和CO之后的第3种气体信号分子4，参与神经和血管功能调节等多种生理和病理过程57。但H2S是否参与ALI的发病尚不清楚。研究发现，H2S和NO共同参与了LPS所致的肺动脉反应性异常8，推测H2S和NO、CO之间可能也存在某种联系。本研究着重观察ALI时H2S及其生成关键酶胱硫醚裂解酶（cystathioninelyase，CSE）的变化；并应用H2S供体NaHS和CSE抑制剂炔丙基甘氨酸（propargylglycine，PPG）观察H2S对ALI时肺组织损伤指标和NO/诱导型NO合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、CO/血红素加氧酶1（hemeoxygenase1，HO1）体系变化的影响，探讨H2S在LPS所致ALI中的作用及可能的机制。1 材料与方法1.1 动物清洁级健康雄性SD大鼠64只，20月龄，体重350400 g（购于河北医科大学实验动物中心），自由摄食、饮水，室温1824，相对湿度40%70%，每日12 h光照维持，昼夜循环。1.2 方法1.2.1 试剂大肠杆菌脂多糖（LPS E.coli O111:B4）、NaHS、炔丙基甘氨酸(PPG)、L半胱氨酸、5磷酸吡哆醛、N，N二甲基对苯二胺硫酸盐、血红蛋白、血红素、NADP、6磷酸葡萄糖和6磷酸葡萄糖脱氢酶均购自Sigma 公司，抗iNOS多克隆抗体、抗HO1多克隆抗体购自博士德公司，SP免疫组化检测试剂盒购自北京中杉生物技术公司，NO与CO、iNOS与HO、丙二醛（MDA）、考马斯亮蓝检测试剂盒购自南京建成生物公司。1.2.2 模型制备SD大鼠适应性喂养1 w后，按窝别随机分为对照组、LPS组、NaHS+LPS组、PPG+LPS组，每组16只。对照组气管内滴注等量生理盐水200 l/只；LPS组气管内滴注LPS（200 g/只，溶于200 l生理盐水中）；NaHS+LPS组LPS滴注前10 min腹腔注射NaHS（28 mol/kg，溶于0.5 ml生理盐水）；PPG+LPS组滴注LPS前10 min腹腔注射PPG（45 mg/kg，溶于0.5 ml生理盐水）。1.2.3 检测指标滴注药物后4 h或8 h颈总动脉放血处死动物。取血浆采用去蛋白的分光光度法5根据H2S标准曲线计算上清液中H2S的含量；采用硝酸还原酶法间接测定血浆NO含量；参照Chalmber等9的双波长分光光度法，以血浆中HbCO的百分比含量(%)代表CO含量；取全肺自气管分叉以上5、6软骨环间剪断气管，用滤纸吸干肺表面血污后称质量测定肺系数肺系数=全肺湿质量(g)/体质量(kg)。留取左侧肺叶下部以10%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片，经HE染色采用分光光度法测定iNOS及HO1活性（HO活性检测采用HO降解血红素生成胆绿素和CO的原理，以1 mg HO蛋白1 h催化血红素降解生成胆红素的pmol数，以此表示HO活性）。取左侧肺叶中上部制备肺组织匀浆，采用硫代巴比妥酸法测定肺组织中MDA含量；参照文献6方法测定肺组织CSE活性（组织中CSE活性以每毫克组织在每分钟生成H2S的nmol表示）。1.2.4 肺组织形态学观察光镜下观察肺组织形态结构变化。每组选取6张玻片，每张玻片连续观察10个视野（100倍），计算损伤肺泡（肺泡内含有红细胞或/和中性粒细胞2个以上）数占计数肺泡总数百分比，即肺泡损伤数比值作为肺损伤的组织学定量评价指标（IQA）。1.2.5 肺组织中iNOS蛋白、HO1蛋白的免疫组织化学检测及计算机图像分析采用SABC法检测大鼠肺组织iNOS蛋白、HO1蛋白表达。切片常规脱蜡、脱水，一抗滴度为1100，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，细胞浆染成棕黄色的即为阳性细胞。用全自动图像分析系统检测肺组织iNOS的平均光密度值，作为iNOS的相对表达量各组取5张切片，每张切片随机取35个视野（400倍）做图像分析，计算5张切片的平均光密度，作为该组阳性细胞的平均光密度。1.3 统计学处理数据均以xs表示，进行正态性检验，多样本均数比较进行方差齐性分析，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用q检验。应用SPSS10.0统计软件进行分析。2 结 果2.1 肺组织形态学改变光镜下对照组肺组织结构清晰，肺泡壁薄，肺泡内未见水肿液，肺泡腔内可见少量淋巴细胞及单核巨噬细胞。滴注LPS后肺泡间隔增厚、断裂，PMN浸润，肺泡内可见浆液、红细胞，且大鼠的肺损伤随时间的延长而加重；与对照组相比IQA明显增高（均P0.05）。NaHS+LPS组肺组织病变较相应时间点的LPS组明显减轻，大部分肺组织接近正常，局部肺组织少量炎细胞浸润，肺泡隔略有增宽，IQA亦较相应时间点LPS组明显下降（均P0.05）。PPG+LPS组肺组织损伤较LPS组加重，IQA亦升高，尤以8 h组明显（P0.05)（图1，表1）。2.2 肺系数和肺组织中MDA含量的变化见表1。肺系数和MDA含量LPS组明显高于对照组（P0.05）和NaHS +LPS组（P0.05），低于PPG+LPS组（P0.05）。表1 各组大鼠肺系数、肺组织MDA含量及IQA的变化(略)2.3 血浆H2S含量和肺组织CSE活性的变化见表2。血浆H2S含量和肺组织CSE活性LPS组低于对照组（P0.05）和NaHS +LPS组（P0.05），高于PPG+LPS组（P0.05）。表2 各组大鼠血浆H2S含量和肺组织CSE活性的变化(略)2.4 血浆NO含量及肺组织iNOS活性的变化见表3。LPS滴注4 h、8 h后血浆NO含量和肺组织中iNOS活性明显高于对照组（P0.05）和NaHS +LPS组（P0.05），低于PPG+LPS组（P0.05）。2.5 血浆CO含量及肺组织HO1活性的变化见表4。LPS 组4 h血浆CO含量和肺组织HO1活性无明显变化，而8 h二者明显增高（P0.05）；NaHS+LPS组血浆CO含量和HO1活性显著高于LPS组及对照组（均P0.05）；PPG+LPS组与LPS组比较血浆CO含量和HO1活性无明显差异。表3 各组大鼠血浆NO含量及肺组织iNOS活性的变化(略)表4 各组大鼠血浆CO含量及肺组织HO1活性的变化(略)2.6 肺组织iNOS表达的变化见表5。对照组肺组织中偶见iNOS阳性细胞；LPS 4、8 h肺组织可见iNOS棕黄色阳性染色信号较对照组明显增强，主要表达部位在肺泡间质的单核巨噬细胞、中性粒细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、支气管上皮细胞，平均光密度值显著高于对照组（均P0.05）；NaHS+LPS组iNOS蛋白表达量较相应时间点的LPS组减弱（P0.05）；PPG+LPS组iNOS蛋白表达量与LPS组比较则明显升高（P0.05）。2.7 肺组织HO1的表达见表5。对照组肺组织中偶见HO1阳性细胞；LPS 4、8 h肺组织可见明显的HO1棕黄色阳性染色信号，主要分布于气道上皮、肺泡壁、血管壁和炎细胞胞质中；NaHS+LPS组HO1蛋白表达量较LPS组增加（P0.05）；PPG+LPS组HO1蛋白表达量与LPS组比较无明显区别。表5 各组大鼠肺组织iNOS蛋白及HO1蛋白相对表达量的变化(xs，n=10)3 讨 论 目前H2S生理和病理作用的研究尚处于起步阶段，但有研究表明，H2S具有多方面的生物学作用，如参与低氧性肺动脉高压和感染性休克5，6以及减轻兴奋性氨基酸对神经元的毒性作用等7。本研究显示，在LPS引起肺组织损伤的同时，血浆H2S含量和肺组织CSE活性下降；预先给予NaHS可使H2S含量和CSE活性升高，肺损伤也明显减轻；预先给予PPG抑制CSE活性和H2S生成，则使LPS所致的肺损伤有所加重。提示H2S/CSE体系的下调在LPS所致ALI的发病学中有一定作用，而给予一定量的外源性H2S对肺组织具有保护作用。关于其保护作用的机制尚不十分清楚。本研究证实，外源性H2S可一定程度减少ALI时肺内MDA的生成，抑制内源性H2S可增加MDA产量，提示H2S具有一定的抗氧化作用，这与其他研究报道H2S具有清除活性氧的作用是一致的10。 NO是最早发现的气体信号分子，可参与生理状态下多种肺疾病的发生11。NOS是合成NO的关键酶，iNOS诱导产生的过量的NO具有细胞毒性作用12，其作用可由ONOO介导13。CO由于近年来被证实具有抗炎、抗氧化等作用而被引起广泛关注。机体内源性CO主要由HO1催化血红素降解产生，可作为保护性蛋白被细菌内毒素、炎性细胞因子、NO等多种因素诱导表达14。但在NO、CO和H2S均参与LPS所致肺损伤的情况下，H2S与前两者的作用是否存在联系还需进一步研究。本研究结果显示，LPS使H2S减少的同时上调NO/iNOS体系，上调CO/HO1体系可能是机体对抗损伤性刺激的一种保护性反应。给予PPG抑制内源性H2S的产生，可进一步上调NO/iNOS，对LPS诱导的HO1表达并无明显影响。给予H2S供体NaHS可下调NO/iNOS、上调CO/HO1，推测ALI时三种气体信号分子间可能存在相互调节的关系，具体机制有待进一步研究。【参考文献】 1 厉 晓，蔡英年,宿双宁.脂多糖诱导地鼠肺泡巨噬细胞中一氧化氮对TNF的调节作用J.基础医学与临床,2000；20(2)：413.2 任光明,赵鸣武,方秋红,等.香烟烟雾提取物对大鼠肺组织的损伤作用及对一氧化氮生成的影响J.基础医学与临床,2000；20(2):447.3 黄新莉,周晓红,凌亦凌,等.内源性CO在CCK28减轻脂多糖所致的急性肺损伤中的作用J.中国病理生理杂志,2005；21(11)：20818.4 Wang R.Twos company，threes a crowd：Can the H2S be the endogenous gaseous transmitterJ? FASEB J，2002；16(3)：179298.5 Chunyu Z,Junbao D,Dingfang B,et al.The regulatory effect of hydrogen sulfide on hypoxic pulmonary hypertension in ratsJ.Biochem Biophys Res Commun，2003；302:8106.6 陈晓波,杜军保,耿 彬,等.感染性和内毒素性休克大鼠动脉组织中硫化氢的变化J.基础医学与临床,2003；23(4):3847.7 Kimura Y，Kimura H.Hydrogen sulfide protects neurons from oxidative stressJ.FASEB J,2004；18:11657.8 戴鸿雁,凌亦凌,黄新莉,等.硫化氢在内毒素血症大鼠动脉舒张反应性改变中的作用及其与一氧化氮的关系J.河北医科大学学报,2004；25(6):355.9 Chalmers AH.Simple,sensitive measurement of carbon monoxide in plasmaJ.Clin Chem,1991；37:14425.10 Whiteman M，Armstrong JS,Chu SH,et