产枯草芽孢杆菌实训报告.pptVIP

生化工艺实训报告,一 产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的优化,1、产淀粉酶枯草芽孢杆菌斜面活化 2、摇瓶发酵优化培养基及种子培养 3、葡萄糖标准曲线的制备 4、发酵参数的测定,1、产淀粉酶芽孢杆菌斜面活化,实验材料 菌种：从土壤中分离产淀粉酶的枯草芽孢杆菌 配方：牛肉膏蛋白胨培养基 蒸馏水400ml、牛肉膏2g、蛋白胨4g、氯化钠2g、琼脂0.2g、PH7.07.2 试剂：牛肉膏、氯化钠、氢氧化钠溶液、蛋白胨、琼脂、盐酸溶液,实验内容,1、制备培养基：依照培养基组成稀释后定容400ml，分装与6个摇瓶中，50ml。剩余溶液分装与6个试管中，均10ml，并加0.2g琼脂。 2、灭菌：高压灭菌锅 121摄氏度 0.11MPa 2030min 3、斜面摆放：灭菌后的试管静止冷却至50摄氏度左右，将试管的液面及搁置的试管斜面长度不超过试管总长一半，凝固后待用。 4、斜面活化：在超净工作台中将保藏的芽孢杆菌接种置已制好的斜面上划线。 5、恒温培养：恒温培养箱 37摄氏度 过夜培养进行活化,2、摇瓶发酵优化培养基,实验材料 试剂：牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 淀粉 葡萄糖 仪器设备：分光光度仪、超净工作台、烧杯、摇瓶、电炉、斜面活化的菌种、牛肉膏蛋白胨液体培养基、玻璃棒等玻璃仪器 实验步骤：,恒温水浴锅,分光光度计,1、摇瓶发酵培养基优化 发酵优化方案,摇瓶发酵培养基优化,实验步骤 依照优化培养基配方制备相应试剂，每个配方平行试验两次 灭菌：将12个摇瓶与高压蒸汽灭菌锅内进行灭菌 121摄氏度 0.11MPa 1520min,种子培养,接种：选取生长状况良好的试管斜面进行接种，挑取活化菌接种到液体培养基中，平行6个 培养条件：37摄氏度 摇床培养 注意事项： 确保在灭菌环境中进行 对培养基进行标注，以免混淆,3、葡萄糖标准曲线的制备,试验步骤 1）DNS试剂的制备：称取3.25gDNS溶与热蒸馏水中，加入2mol/L氢氧化钠溶液162.5ml，再加入22.5ml丙三醇，摇匀，冷却后定容500ml，待用。 2）葡萄糖标准试剂待用中 3）在下述试管中分别加入DNS 试剂2ml于沸水浴中加热2min进行显色，取出后立即冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在分光光度计中540nm波长处测定光吸收值。 4）以葡萄糖含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线,葡萄糖标准溶液,葡萄糖标准曲线,3、发酵参数的测定,实验步骤 在超净工作台上将方案1、2、3、4、5均按2%接种量进行接种，在180r/min的摇床进行培养；方案6接种4%在120r/min的摇床上进行培养。每隔一小时进行取样（包含0小时），检测酶活、菌浓、及其PH值。 根据各数据挑选最优培养方案。,生长曲线绘制,将取样稀释后与分光光度计（波长600nm）测OD值，空白为蒸馏水。 绘制生长曲线，横坐标为培养时间，纵坐标为菌浓。,生长曲线参数数据,生长曲线,酶活测定,发酵液离心处理 8000rpm 5min 1ml离心后的上悬液加入5ml1%淀粉溶液与37摄氏度水浴5min，然后沸水浴5min，终止反应。 取上述溶液1ml加入DNS试剂2ml与沸水浴加热，2min进行显色反应，取出后迅速冷却，各加入9ml蒸馏水，摇匀，在540nm波长处测光吸收值。以发酵液加1%淀粉溶液直接加热，煮沸后再加2mlDNS试剂，作为空白。,酶活测定参数数据,酶活曲线,实验总结分析,根据生长曲线图及酶活曲线，可得方案5的培养基为最优培养基。 根据本组试验结果分析淀粉量的增加未使菌体的生长量及酶活有一定量的增加，分析有可能是试验过程中操作不当，或染菌。,二 青霉素发酵生产仿真操作,操作步骤 空罐灭菌 实罐灭菌 正常发酵 重要参数： 补糖 初始参数20 硫氨 初始参数12 前体15 氨水10 消泡剂 初始80 排气37 空气进气55,二 枯草芽孢杆菌实罐操作,青霉素仿真总结及分析,仿真操作加强了同学们的动手能力及对实操的认识及掌握。 在不断的练习中，逐步熟练并对参数数据有了更加清楚的掌握和控制。 对同学们的实操奠定了基础。,枯草芽孢杆菌发酵的实罐操作,二 枯草芽孢杆菌的实罐操作 实验材料及仪器设备,10L-100L 二级发酵罐及其附属设备 分光光度计 旋转式摇床 离心机 水浴锅 恒温培养箱 超净工作台 全自动灭菌锅 摇瓶 移液管 玻璃棒 烧杯 等玻璃仪器 试剂 牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 蒸馏水 氢氧化钠 DNS试剂 1%淀粉,实训意义,生化工艺实训是为了让学生掌握一定的生物化工工艺单元操作基本技能的基础上进行的一次综合性实践训练。主要对有机品发酵过程中常见的单元操作过程及设备进行的基本操作技能训练。,防止染菌的要点,染菌是抗生素发酵的大敌，不制服染菌就不能实现优质高产。影响染菌的因素很多，而且带随机性质，但只要认真对待，过细地工作，染菌是可以防止的。请到左边的导航栏里选择查看防止染菌的要点的内容。,空气系统的要求,防止空气带菌主要是提高空压机进口空气的洁净度，防止空气夹带油和水及空气过滤器失效。 提高空压机进口空气的洁净度，可以从提高吸气口的位置及加强空气的压缩前过滤着手。防止空气夹带油、水，除加强去除油、水的措施外，还必须防止空气冷却器漏水，注意勿使冷却水压力大于空气压力，防止冷却水进入空气系统。,蒸汽系统的要求,重视饱和蒸汽的质量，要严防蒸汽中夹带大量冷凝水，防止蒸汽压力大幅度波动，保证生产时所用的蒸汽压力在3035千帕以上。,1、连续灭菌设备：连消塔结构要求简单，易于拆装和清理，操作时蒸汽能与物料混合均匀，并易于控制温度。 2、发酵罐：发酵罐及其附属设备应注意严密和防止泄漏，避免形成“死角”。凡与物料、空气、下水道连接的阀门都必须保证严密度。 3、无菌室：用超净工作台及净化室代替无菌室，以提高无菌程度。,一、种子的制备,种子的制备 培养基 牛肉膏 0.5g 蛋白胨 1g 氯化钠 0.5g 蒸馏水 100ml PH 7.07.2 将配置好的培养基放入250ml的三角瓶中装液量为100ml，数量11个 。装液后进行高温灭菌。,一级种子的制备 选取长势良好的菌种，挑取菌落23环接种导液体摇瓶中。 培养条件：180r/min，37摄氏度摇床过夜培养。 二级种子液的制备 将初级种子液接种到药瓶培养基中接种量为2ml。 培养条件：180r/min，37摄氏度摇床过夜培养。,二、发酵液配置,发酵培养基配方：牛肉膏1%、 蛋白胨8%、蔗糖3%、淀粉1.5%、氯化钠0.5%、蒸馏水 86%、硫酸铵0.4% 无水氯化钙0.2%。 将发酵培养基按照上述配方比例配好共配培养基45L，因为在蒸汽灭菌过程中会产生大量的冷凝水，导致发酵培养基被稀释，所以初始加入的培养基为45L,这样可以避免培养基的稀释。,三、空罐灭菌,空气过滤器灭菌，灭菌后对空气过滤器通空气进行保压，使压强保持在0.10.15mpa之间防止染菌。 对罐体进行夹套预热85摄氏度以上。 温度到达后，关闭夹套进气开关。通热蒸汽对罐体经行升温，当温度达到120摄氏度、压强0.11mpa时，保持温度和压力20min。 灭菌后，关闭蒸汽进气阀，开大放气阀，进行泄压。,四、实罐灭菌,泄压后，从进料口开始添加培养基，并开始搅拌（转速130r/min） 进料完毕后开始调节PH值 调好PH后，对罐体进行夹套预热85摄氏度以上。 温度到达后，关闭夹套进气开关。通热蒸汽对罐体经行升温，当温度达到120摄氏度、压强0.11mpa时，保持温度和压力20min。 灭菌后，关闭蒸汽进气阀，开大放气阀，当压强下降到0.08mpa时开启通气阀。使罐内压力保持在0.05mpa左右。 开启冷水阀门，对发酵罐进行降温。,五、接种,当罐温降到37摄氏度后，关闭冷水。用酒精将接种口处仔细擦洗，并放上接种火圈。 减少进气，使罐压保持在0.02MPa，点燃接种火圈。 拧下进料口螺盖，放入酒精中,以免染菌。 按接种瓶的瓶口在火焰上灼烧一下，并在火焰的保护下，迅速将菌种倒入发酵罐。 盖上进料口螺盖，熄灭火焰。并用酒精仔细清洗。,接种 在无菌环境下进行,六、发酵,发酵条件：37摄氏度、压强0.07kpa、搅拌转速200r/min 取样：取样前用热蒸汽将出料口处进行灭菌10min。 发酵参数的测定 1、PH值的测定：用精确的PH试纸测。,2、生长曲线：分光光度计波长600nm测od值（以相同稀释倍数的培养基做空白）。以生长量为纵坐标，培养时间为横坐标绘制生长曲线图。 3、淀粉酶活力的测定： 1)样品液的制备： 发酵液离心处理：8000rpm，5min 1ml离心后的发酵液+5ml 1%淀粉溶液与37摄氏度水浴反应，然后沸水浴5min终止反应。 取上述溶液1ml，加入DNS试剂2.0ml于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用水迅速冷却 ，加去9ml蒸馏水，摇匀，在540nm波长处测定吸光值。 2）空白液的处理： 发酵液离心处理：8000rpm，5min 1ml离心后的发酵液+5ml 1%淀粉溶液直接加热煮沸5min，取1ml，加入DNS试剂2.0ml于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用水迅速冷却 ，加去