心血管系统药物筛选.ppt

心血管药物活性快速筛选方法,郭秀丽 新药药理研究室,药物活性筛选,抗心肌缺血/再灌注损伤与缺血预适应药物筛选,抗心功能不全药物筛选,讲授内容,抗高血压药物筛选,影响微循环药物筛选,抗心律失常药物筛选,抗动脉粥样硬化药物筛选,心肌电生理实验法,心血管细胞的培养及应用,第一部分 心血管细胞培养与检测,原代心肌细胞： 采用乳大鼠心肌组织块多次反复低浓度胰酶消化方法，可得到生长迅速、活性好、纯度高的心肌细胞。 利用心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同, 采用差速贴壁1h, 除去成纤维细胞，达到纯化的目的。 二者形态差异很大，很好鉴别 。,方法：,心肌细胞培养及应用,心肌细胞形态：,心肌细胞培养,刚接种时形状为圆形或椭圆形，大约在一天左右基本贴壁，此时细胞伸出伪足，伪足在镜下为纤维状条索，细胞胞体则呈现不规则形状，如多角形，部分细胞有聚集倾向，细胞搏动效果较好。,心肌细胞培养在药理学研究中的应用,（1）观察药物对体外培养正常心肌细胞的影响。 （2）观察药物对不同心肌细胞损伤模型的作用。 缺血损伤模型： 模拟临床缺血性心脏病的发病机制，减少能量及氧的供给，可产生心肌细胞的缺血样损伤。 方法：培养的心肌细胞，用不含葡萄糖的Eagle培养液充入高纯氮气，饱和15min，置换掉培养瓶中的正常培养基，再向瓶内充氮30s，然后塞紧瓶塞。给药组及其它各组心肌细胞培养瓶置于孵箱静置培养6h，造成损伤。,心肌细胞培养在药理学研究中的应用,（1）观察药物对体外培养正常心肌细胞的影响。 （2）观察药物对不同心肌细胞损伤模型的作用。 感染性损伤： 用多种病毒或其他微生物感染心肌细胞，模拟心肌炎，形成细胞病理模型。 中毒性损伤： 生物毒素如白喉毒素，链球菌溶血素，副溶血弧菌毒素等，均可造成培养心肌细胞的中毒性损伤。化学毒物如丝裂霉素，阿霉素，烟碱，一氧化碳，氰化钠，造成中毒性损伤.,（1）观察药物对体外培养正常心肌细胞的影响。 （2）观察药物对不同心肌细胞损伤模型的作用。 免疫性损伤： 特异性或交叉反应性抗体与结合了补体的心肌细胞表面抗原之间发生反应，可引起心肌细胞的免疫性损伤。用大鼠心肌匀浆给家兔皮下注射，每周一次，共五次，经鼠心抗原诱导，在兔体内形成抗鼠心抗体，制备成-球蛋白，与补体加入培养瓶，使心肌细胞发生免疫性损伤。 心力衰竭： 在培养2-3天的心肌细胞培养瓶中加入戊巴比妥钠，可诱导搏动减慢，甚至停博。用强心剂有明显治疗作用。,心肌细胞培养在药理学研究中的应用,（1）观察药物对体外培养正常心肌细胞的影响。 （2）观察药物对不同心肌细胞损伤模型的作用。 （3）观察药物对心肌细胞搏动节律的作用。 改变培养基中的离子浓度： 例如钠、钾、钙、镁等浓度，可使心肌细胞搏动加快、减慢、节律失常、纤颤等。 药物诱发节律失常： 心肌细胞培养瓶中加入哇巴因、乌头碱或地高辛等，可诱发节律失常，细胞发生颤动、扑动或扭动。,心肌细胞培养在药理学研究中的应用,（1）观察药物对体外培养正常心肌细胞的影响。 （2）观察药物对不同心肌细胞损伤模型的作用。 （3）观察药物对心肌细胞搏动节律的作用。 （4）观察药物对受体的影响。 利用放射配基受体结合法分离、提纯、鉴定受体，进行直接研究，用以说明受体的实质及各类药物的作用机制。 亦可用拮抗效应证实药物对各类受体的作用，激动剂或拮抗剂。,心肌细胞培养在药理学研究中的应用,（1）观察药物对体外培养正常心肌细胞的影响。 （2）观察药物对不同心肌细胞损伤模型的作用。 （3）观察药物对心肌细胞搏动节律的作用。 （4）观察药物对受体的影响。 （5）观察药物对离子通道的影响。 利用膜片钳技术，采用单个心肌细胞观察药物对钠、钾、钙等离子通道的作用研究，证实药物对离子通道的开放、关闭的作用。,心肌细胞培养在药理学研究中的应用,第一部分 几类心血管细胞培养与检测,平滑肌细胞是血管中膜的主要细胞成分，在各种病理生理或体外培养条件下，可迅速增殖、迁移、合成并分泌细胞基质，在血管性疾病的发生、发展中起着重要的作用。,培养方法： 较多，主要有分散细胞原代培养法，组织块培养法，微血管平滑肌细胞培养，平滑肌细胞蜕变培养，复合培养等,血管平滑肌细胞培养,组织来源： 兔、大鼠、猪、牛、羊等血管，都可用。取材部位，胸主动脉、降主动脉、肺血管、脑血管、脐血管等。,第一部分 几类心血管细胞培养与检测,培养方法： （1）分散细胞原代培养法 超净台内，新鲜的动脉剥去血管表面的纤维、脂肪和多余的血块。移入含酶消化液(胶原酶、弹性酶)中，37消化30min，剥去外膜及外层中膜并用Hanks 液冲洗动脉条内壁以除去内皮细胞，将动脉条移入另一含酶消化液中， 37消化23h，收集细胞悬液，计数，接种。2h后开始贴壁，每23d更换培养液，12周出现致密细胞层，传代.,血管平滑肌细胞培养,第一部分 几类心血管细胞培养与检测,超净台内，清洗干净的血管置于含有培养液的平皿中，将剥去外、内膜的动脉中层切成1mm3的组织小块，规则排列于培养瓶中，倒置培养瓶，加入培养液，孵箱中培养5h，翻转培养瓶，使组织块浸于培养液中，静置培养。细胞自组织块边缘长出，23周可出现致密的细胞层。,血管平滑肌细胞培养,培养方法： （2）组织块培养法,第一部分 几类心血管细胞培养与检测,培养方法： （3）微血管平滑肌细胞培养法 超净台内，取出大脑半球，剪碎并匀浆，过200目尼龙网，得到大脑组织块，溶于酶消化液（弹性酶，胶原酶，大豆胰酶抑制剂等） 37水浴震荡培养60min，组织悬液用吸管吹打，离心，细胞团块悬浮于培养基，孵箱培养1218h，吸去未贴壁细胞和细胞团块，形成致密层，可传代培养。,血管平滑肌细胞培养,第一部分 几类心血管细胞培养与检测,培养方法： （4）平滑肌细胞蜕变培养 病毒的细胞毒作用引起平滑肌蜕变造成血管损伤，是血管性疾病的重要病理机制之一。 传代平滑肌细胞，经SV40感染2h，感染的细胞用Hanks F12K培养液培养一周，以1：3的比率用同样培养液传代培养三周左右，可见不规则生长的蜕变细胞，积聚在另一个细胞上，收集蜕变细胞，培养在DMEM中，建立蜕变平滑肌细胞培养模型。,血管平滑肌细胞培养,第一部分 几类心血管细胞培养与检测,平滑肌细胞和内皮细胞的体位复合培养，在一定程度上模拟体内血管壁的结构，有助于阐明药物对血管壁的影响。 利用PET膜，调整内皮细胞数接种于膜的一面，当形成致密单层后，加入平滑肌细胞至膜的另一面，建立复合培养模型，可用于观察药物对内皮细胞和平滑肌细胞生长和分化及平滑肌细胞的迁移等的影响。,血管平滑肌细胞培养,培养方法： （5）复合培养,第一部分 几类心血管细胞培养与检测,形态： 原代和5代以内的平滑肌细胞常呈针形，5代以上的平滑肌细胞形状增大，呈典型的生长形式即细胞成梭形或长梭形，平行生长，束状排列，亦可重叠生长达多层。,血管平滑肌细胞培养,第一部分 几类心血管细胞培养与检测,人脐静脉内皮细胞培养 原代培养：采用酶液灌注消化法 新生儿脐带，用PBS将管腔冲洗干净。一端用止血钳夹紧，一端用注射器注入胶原酶使脐静脉充盈。孵育20min后，用小镊子按摩使内皮细胞脱落。收集消化液，置于培养瓶中培养。12h后更换培养液，约710d细胞融合，呈铺路石样镶嵌式单层排列。 传代培养：排列成单层后，可传代10代以上。,血管内皮细胞培养,第一部分 几类心血管细胞培养与检测,内皮细胞的鉴定 形态学：铺路石样镶嵌式单层排列 因子间接免疫荧光检测：内皮细胞的特异鉴定法。 加入第因子相关抗原诊断血清， 再加入异硫氰酸荧光素FITC标记 的羊抗兔IgG血清，在荧光显微镜 下见细胞核周呈黄绿色亮荧光环， 阳性反应。,血管内皮细胞培养,第一部分 几类心血管细胞培养与检测,人牛或猪主动脉内皮细胞培养 原代培养：内膜消化刮取法 在主动脉近心端剥去外膜，纵向剪开动脉。将动脉内膜面朝下覆盖于酶液上消化， 37孵育15min，终止消化后用塑料小勺来回轻刮内膜数次，使内皮细胞脱落。收集后离心细胞，制成细胞悬液置于培养液中培养，一周后细胞融合，可传代。 传代培养：10代以上,血管内皮细胞培养,阿霉素心肌细胞损伤保护模型； 心肌细胞活力测定； 作用于内皮细胞释放NO的药物筛选模型； 血管内皮细胞氧化损伤保护模型； 血管内皮细胞ox-LDL损伤保护模型； 血管平滑肌细胞迁移率测定模型； Ang诱导VSMC增殖的抑制活性筛选模型,心血管细胞的药物筛选模型,一、心肌缺血与梗死范围测量指标与方法,1. 形态学方法： 一是组织学方法；一是大体标本染色法。 组织学切片： 用光镜作组织学切片检测心肌缺血和梗死范围，直接可靠；但需要作一系列切片才能准确定量，费时费力。 大体标本染色法：常用 染料：无色的氧化型染料硝基四氮唑蓝(NBT)，在心肌脱氢酶作用下，还原成还原型的蓝色NBT，使活体心肌染色；心肌梗塞后心肌脱氢酶活性丢失，故梗死心肌不被蓝染。,第二部分 抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选,一、心肌缺血与梗死范围测量指标与方法,2. 酶学法： 肌酸激酶测定法 肌酸激酶（CK）广泛存在于骨骼肌、心肌和脑组织中，这些组织受损伤时细胞内CK因释放而减少，血清中CK活性增加。测定组织及血清中CK活性变化能反映组织损伤情况，也可作为心肌梗死范围的定量指标。 测定方法： 肌酸量测定法、紫外分光测NADPH方法、定磷法等,第二部分 抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选,一、心肌缺血与梗死范围测量指标与方法,2. 酶学法： 乳酸脱氢酶测定法 乳酸脱氢酶（LDH）也是存在于心肌和脑组织中的一种酶，这些组织细胞膜受损时细胞内LDH释放，血清中LDH活性增加。测定组织及血清中LDH活性变化能反映组织损伤情况，也可作为心肌梗死范围的定量指标。 测定方法： 比色测定法，紫外分光光度计法等,第二部分 抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选,二、在体心肌梗死模型,1. 大鼠法： 乌拉坦麻醉，连接呼吸机，在第四或第五肋间钝性分离肌层，打开胸腔，在心脏动脉圆锥与左心耳之间冠状静脉处结扎左冠状动脉，缝合胸壁。 急性试验即可观察药物的作用，如ECG的变化，心律失常发生率，梗死范围等 亚急性实验，注射青霉素和链霉素防止感染。 方法简便易行，但结扎手术有不成功例，观察ECG波形.,第二部分 抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选,二、在体心肌梗死模型,2. 家兔法： 乌拉坦麻醉，沿胸骨左缘剪断13根肋软骨，不破坏胸膜可不连接呼吸机。打开胸腔，提起左心耳，在冠状动脉前降支根部穿线结扎。也可在该部位下0.5cm处再穿一线，可扩大梗死面积，便于观察药物疗效。 观察指标：ECG ST段异常抬高，病理性Q波的出现； NBT染色；CK或LDH活性,第二部分 抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选,第二部分 抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选,二、在体心肌梗死模型,3. 狗实验法： 杂种狗，戊巴比妥钠麻醉，气管插管行人工呼吸，沿胸骨左缘第四或第五肋间开胸，暴露心脏。分离冠状动脉前降支主干中下1/3交界处，描记好对照的心外膜心电图。结扎分离处，造成急性心梗。观察药物疗效。 观察指标：ECG ST段异常抬高，病理性Q波的出现； NBT染色；CK或LDH活性,第二部分 抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选,三、离体大鼠心肌缺氧、再给氧损伤模型,改良Langendorff离体心脏灌流法： 正常离体心脏在缺氧再给氧时，可加剧心肌组织缺血性损伤，与临床冠脉搭桥术、溶栓术及冠脉痉挛等再灌注心肌损伤相似。可筛选防治再给氧损伤的有效药物。 心脏从体内取出后，将主动脉套入装置中的主动脉插管以线结扎固定。2min内完成。通入含95%O2和5%CO2的Krebs-Henseleit液灌流。在肺动脉起始部与右室圆锥部之间剪一小口，以利冠脉回流液的排出。,第二部分 抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选,第二部分 抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选,三、离体大鼠心肌缺氧、再给氧损伤模型,改良Langendorff离体心脏灌流法： 以带线的蛙心夹夹住心尖，与肌力换能器相连，记录心肌收缩幅度和张力。 可进行多种缺氧损伤模型： 缺氧不同时间后再给氧（再灌注）； 局部缺血再灌注损伤； 低灌缺血再灌注损伤；停灌缺血再灌注损伤； 再灌注心律失常,第二部分 抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选,三、离体大鼠心肌缺氧、再给氧损伤模型,改良Langendorff离体心脏灌流法： 测量指标： 冠脉流量：收集冠脉回流液 心肌收缩功能和舒张功能：LVP，LVEDP，dp/dtmax 心电图 心肌匀浆CPK、LDH、ATP、MDA、氧自由基等 光镜或电镜形态学观察,第二部分 抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选,四、体外培养乳大鼠心肌细胞缺氧、再给氧损伤模型,心肌细胞缺糖缺氧损伤 心肌细胞缺氧/再给氧损伤 观测指标： 胎盘蓝染色法测定心肌细胞存活率 测定心肌细胞培养液中LDH（较CPK稳定） 心肌细胞MDA含量 心肌细胞自由基含量 心肌细胞膜流动性等,第二部分 抗心肌缺血/再灌注损伤药物筛选,引起实验性心律失常的方法很多,包括： 药物诱导心律失常； 电刺激引起心律失常； 结扎冠状动脉引起心律失常； 利用体外心肌细胞和电生理技术研究抗心律失常药对心肌细胞的分子机制等。,第三部分 抗心律失常药物筛选,第三部分 抗心律失常药物筛选,造成的实验性心律失常类型, 包括： 1. 房性心律失常模型： (1) 心房局部应用Ach、乌头碱引起心房颤动； (2) 电刺激心房引起心房颤动； 2. 室性心律失常模型 (1) 肾上腺素或氯仿-肾上腺素引起室性心律失常 (2) 强心苷引起室性心律失常 (3) 乌头碱引起室性心律失常 (4) 氯化钡或氯化钙引起室性心律失常 (5) 电刺激心室引起心室颤动 (6) 冠状动脉两步结扎引起室性心律失常,第三部分 抗心律失常药物筛选,造成的实验性心律失常类型,包括： 3. 对心肌自律性、不应期、传导性、兴奋性影响的模型： 4. 抗心律失常药对心肌电生理特性影响的实验模型 5. 体外培养心肌细胞的模型,观察指标： 以心电图导联记录以观察心律失常的发生时间、发生类型、持续时间等； 用药方法可用预防给药和治疗给药,第三部分 抗心律失常药物筛选,常用实验性心律失常造模的动物： 小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猫等 特点： 大鼠、豚鼠、兔和猫的心室颤动有自发恢复的可能， 狗的很难恢复； 小鼠用氯仿致心室颤动初筛药物； 大鼠对强心苷不敏感，不宜用哇巴因诱发心律失常； 豚鼠、家兔还适于作离体心脏心律失常等模型。,第三部分 抗心律失常药物筛选,一、药物诱发心律失常模型 1. 氯仿、氯仿-肾上腺素或肾上腺素所致的心律失常 大剂量肾上腺素提高心肌的自律性； 氯仿与肾上腺素合用增加对心脏的毒性。,（1）氯仿引起小鼠心室颤动模型：吸入 （2）氯仿-肾上腺素引起心律失常模型：氯仿吸入，Adr静注 （3）肾上腺素致狗心律失常：实验前一天先给狗静注酒石酸锑钾，再静注肾上腺素更易引起心律失常。,第三部分 抗心律失常药物筛选,一、药物诱发心律失常模型 2. 强心苷类诱发心律失常 强心苷中毒可出现多种类型的心律失常。 常用的强心苷：哇巴因，地高辛，西地兰等 （1）哇巴因诱发狗室性心律失常 （2）哇巴因诱发豚鼠心律失常 （3）强心苷对离体心脏诱发心律失常：加在灌流液中，可预防给药或治疗给药,第三部分 抗心律失常药物筛选,一、药物诱发心律失常模型 3. 乌头碱诱发心律失常 机制：激活了心肌细胞的钠通道，使钠通道开放，加速心肌细胞Na+内流,促使细胞膜去极化，加速自律性，诱发异位节律点，形成多源性异位节律，缩短心肌不应期，导致心律失常。 对整体动物、开胸局部应用、离体灌流心脏均可诱导心律失常发生。,第三部分 抗心律失常药物筛选,一、药物诱发心律失常模型 4. 氯化钡或氯化钙诱发心律失常 机制：钙离子对心脏的直接作用，还与肾上腺素能神经对心脏的影响有关。预先破坏大鼠中枢与支配心脏的交感神经有关部位，或给予神经节阻断剂，可部分对抗氯化钙诱发的心律失常。 静脉注射给予氯化钡或氯化钙。,第三部分 抗心律失常药物筛选,一、药物诱发心律失常模型 5. 心房局部应用ACh诱发心房颤动法 机制：心房局部应用Ach诱发心房颤动的原因可能是兴奋折返的结果，是由于Ach对局部阻滞而影响正常传导通路，同时缩短心房不应期，降低收缩强度等作用。,局麻开胸动物，用浸有5%Ach小棉球置于窦房结区，观察心电变化，1min后用无齿镊子轻捏心房引起心房颤动。,第三部分 抗心律失常药物筛选,一、药物诱发心律失常模型 6. 脑室内给药诱发心律失常法 某些药物如戊四唑、印防己毒素、洋地黄等注入脑室内可诱发心律失常，所用剂量较小。 机制：中枢性兴奋迷走和交感神经的结果。 狗、大鼠均可，主要引起室性心律失常。,第三部分 抗心律失常药物筛选,二、电刺激诱发心律失常模型 1. 电刺激下丘脑诱发心律失常 下丘脑是影响心跳节律的重要神经中枢之一，刺激下丘脑可诱发心律失常，神经和精神因素被认为是产生室性心律失常和突然死亡的一个因素。提示可通过调节神经系统功能来治疗心律失常。 动物：家兔、猫等,第三部分 抗心律失常药物筛选,二、电刺激诱发心律失常模型 2. 电刺激心脏诱发心律失常 优点：适度电刺激完全是可逆性的，不损伤心肌，比其他方法更接近自然的异位冲动。 特点：按刺激电极所放位置的不同，可诱发房性或室性心律失常。随刺激强度的不同可引起早搏、心动过速、扑动或纤颤。 动物：狗、家兔、猫等 在体心脏或离体心脏组织均可,第三部分 抗心律失常药物筛选,二、电刺激诱发心律失常模型 2. 电刺激心脏诱发心律失常 （1）诱发在位心房颤动法：开胸暴露心脏，用细软带钩的电极钩入心房，另一端连接方波刺激器。用低强度高频率直流电刺激，记录导联心电图。 （2）诱发在位心室颤动法：开胸暴露心脏，将做电极用的钢制小夹子正极连接于心尖部，负极连接于右心室部，将电极的另一端接于方波示波器监视心律变化，记录导联心电图。,第三部分 抗心律失常药物筛选,二、电刺激诱发心律失常模型 2. 电刺激心脏诱发心律失常 （3）心导管电极诱颤法：电极放置类似心导管右心插管。 （4）狗缺血心脏程控电刺激致室性心律失常模型： 狗冠脉二期结扎并部分再灌注及吻合支缝扎法造成狗急性前壁心肌梗死，58天，狗自发性心律失常消失后，用心室程控刺激可重复诱发出快速室性心律失常，发生机制为折返的形成。,第三部分 抗心律失常药物筛选,二、电刺激诱发心律失常模型 2. 电刺激心脏诱发心律失常 （5）心肌细胞迟后除极和触发心律失常药理模型 强心苷等药物可致细胞内钙离子过多而诱发Na+短暂性内流而引起迟后去极化甚至触发心律失常。 本法利用标准微电极技术记录豚鼠乳头肌动作电位，并结合哇巴因或异丙肾上腺素等观察药物对迟后去极化及触发性心律失常的影响。,第三部分 抗心律失常药物筛选,三、冠状动脉结扎诱发心律失常模型 1. 冠状动脉两步结扎法 冠状动脉结扎造成心肌缺血梗死诱发心律失常是由于传导障碍而产生单向传导阻滞和兴奋折返的结果，与临床急性心肌梗死病人产生心律失常极为相似。多用狗 一次结扎动物死亡率较高，多死于早期室性颤动。采取两步结扎法可避免。 先打松结，插入针头后结扎第一结，抽出针头，30min后再扎紧第二结。,第三部分 抗心律失常药物筛选,三、冠状动脉结扎诱发心律失常模型 2. 麻醉大鼠冠状动脉结扎诱发心律失常 用细小弯针在冠状动脉左前降支下穿一丝线，打一虚结将心脏放入胸腔。此时大鼠会发生短暂心律失常和血压降低。稳定15min后，再结扎冠状动脉。此时出现血压明显下降，心率变化不大。约在结扎后5min动物出现明显的室性异位心律，有VP、VT、VF等。30min时最明显。 动物小易得，操作较狗简单，常作为抗心律失常药物筛选的有效方法。还可观察药物对冠状动脉结扎后心肌梗死面积的影响。,第三部分 抗心律失常药物筛选,三、冠状动脉结扎诱发心律失常模型 3. 心肌缺血再灌注致心律失常模型 缺血再灌注损伤表现为再灌注心律失常、心肌顿抑、结扎损害和心肌内出血等。 机制：自由基和胞内钙超负荷两个因素。 动物：大鼠、豚鼠 方法：大鼠缺血再灌心律失常法；离体大鼠工作心脏缺血再灌致心律失常；豚鼠离体工作心脏缺血再灌致心律失常,第三部分 抗心律失常药物筛选,三、冠状动脉结扎诱发心律失常模型 4. 清醒大鼠冠状动脉结扎诱发心律失常 麻醉大鼠的缺点：在麻醉下心血管功能及神经反射受到抑制，且麻醉药的种类和麻醉深度对心律失常产生影响。 清醒大鼠：乙醚麻醉手术，在冠状动脉下穿线，套硬塑料管，引出体外。缝合动物，撤去乙醚。术后第5天，连接记录心电图，之后结扎冠状动脉，观察心律失常的发生。 清醒大鼠冠脉结扎诱发心律失常较麻醉大鼠严重。 松开结扎线，恢复冠脉血流，研究药物对再灌注心律失常的保护作用。,第三部分 抗心律失常药物筛选,四、抗心律失常药对心肌基本特性影响 1.抗心律失常药对心肌自律性的影响 凡能加快4相Na+(Ca2+)内流或抑制K+外流的因素都能增加自律性，反之，阻止4相Na+(Ca2+)内流或促进K+外流的药物可降低自律性。 （1）药物对离体大鼠右心室实验性自律性的影响 取出大鼠心脏，取下右心室肌，悬挂于离体浴槽，标本与肌力换能器相连，记录收缩曲线。 观察：药物浓度在1050umol/L能抑制50%以上的收缩频率，则有可能为有效的抗心律失常药。,第三部分 抗心律失常药物筛选,四、抗心律失常药对心肌基本特性影响 1.抗心律失常药对心肌自律性的影响 (1) 药物对离体大鼠右心室实验性自律性的影响 (2) 蟾蜍心房标本动作电位 蟾蜍心房标本兴奋节律来自静脉窦，通过记录心房肌动作电位，以窦性固长（SCL）变化为指标了解药物对相对窦房结自律性的影响。 方法：用微电极操纵器将玻璃微电极插入心房肌细胞内引导动作电位，记录于生理记录仪上。浴液内加药，可观察药物的作用。,第三部分 抗心律失常药物筛选,四、抗心律失常药对心肌基本特性影响 1.抗心律失常药对心肌自律性的影响 (1) 药物对离体大鼠右心室实验性自律性的影响 (2) 蟾蜍心房标本动作电位 (3) 心肌细胞搏动频率 用倒置显微镜观察到培养的心肌细胞出现了节律搏动后，联上光电换能器放大并记录细胞搏动频率和收缩幅度，培养液中加入药物，可比较药物前后频率和幅度的变化。,第三部分 抗心律失常药物筛选,四、抗心律失常药对心肌基本特性影响 2.抗心律失常药对心肌不应期的影响 离体兔左心房标本，沿左心房缺口处剪去腹面的心房肌，保留的一面心房肌呈三角形的扇状标本。修剪好的心房肌悬吊于浴管内，将刺激电极贴在心房标本的下部。 给予单脉冲刺激，能诱发左心房收缩最低刺激电压为阈电压。调整刺激电压为5倍阈电压，示波器上显示单收缩波形。稳定3045min后，用成对刺激法测定功能性不应期。加入药物，可观察药物对功能性不应期的影响。,第四部分 抗动脉粥样硬化药物筛选,动脉粥样硬化（AS）的发病与脂质代谢紊乱密切相关，测定血脂及脂蛋白水平和建立AS病理模型，是研究抗AS药的重要手段。,一、血脂测定法,1. 血清总胆固醇(TC)酶法测定 2. 血清游离胆固醇(FC)及胆固醇(CE)的酶法测定 3. 血清甘油三酯(TG)二步酶法测定,第四部分 抗动脉粥样硬化药物筛选,二、组织中的脂质测定,脂质代谢紊乱亦表现于组织，特别是肝脏与动脉壁。测定前需分离提取。 提取方法：肝脏每100mg湿重加提取液 (1:1氯仿与甲醇) 2ml,研成匀浆，再补加提取液3ml，混匀。 动脉需先剪碎，加提取液。检测方法同前述。,第四部分 抗动脉粥样硬化药物筛选,三、血脂蛋白测定,脂蛋白(lipoprotein) 是脂质存在于血浆的形式，由脂质与载脂蛋白(apo)结合而成，分为各种密度的脂蛋白，与AS有不同的关系。 化学沉淀法测定脂蛋白 (1) 低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的测定 (2) 高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的测定,2. 超速离心法分离脂蛋白 借各种脂蛋白的密度不同，可在不同密度的介质中经超速离心，进行分离。,第四部分 抗动脉粥样硬化药物筛选,四、载脂蛋白的测定,载脂蛋白是脂蛋白的蛋白质部分，在脂质代谢中起着关键作用。 测定方法： 层析分离蛋白定量法， 电泳分离染色扫描法， 免疫分析法，特异性高，发展快,第四部分 抗动脉粥样硬化药物筛选,五、脂质过氧化物及 氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)的测定,脂质过氧化物的测定：MDA 氧化型低密度脂蛋白的测定 先用Cu2+催化LDL氧化修饰为氧化LDL (Ox-LDL) ，然后再测定LDL被氧化的程度，而推测Ox-LDL 的含量。,第四部分 抗动脉粥样硬化药物筛选,六、影响脂质代谢有关酶活性的实验,HMG-CoA还原酶测定 该酶是合成内源性Ch的限速酶，能促使HMG-CoA还原成甲羟戊酸，成为合成Ch的中间体。将此酶加于14C HMG-CoA反应液，经一定时间孵温后测定14C 甲羟戊酸内酯含量，可判断HMG-CoA还原酶的活性强度。 观察药物对HMG-CoA还原酶的影响。 采用体外反应体系直接检测药物对酶的抑制作用； 或采用体外培养肝细胞检测。,第四部分 抗动脉粥样硬化药物筛选,六、影响脂质代谢有关酶活性的实验,2. LCAT的活性测定 卵磷脂Ch酰基转移酶(LCAT)能催化卵磷脂-位的脂酰基转移至FC的3-羟基生成CE，使血浆中FC减少，CE增加，促使Ch的异向转移；如果药物能增加此酶活性，有利于防治AS。 检测时，以卵磷脂和FC作底物，加待测血清，测血清中CE的生成量，间接表示LCAT的活性。,第四部分 抗动脉粥样硬化药物筛选,六、影响脂质代谢有关酶活性的实验,3. 脂蛋白脂酶和肝脂酶活性测定 脂蛋白脂酶(LPL)和肝脂酶(HL)都是脂代谢所需的酶，LPL主要存在于毛细血管内皮细胞，HL主要在肝窦内皮细胞，都可能被肝素释放，分解脂蛋白核心成分TG。 检测时，先应用肝素，测两酶的活性，再应用LPL抑制剂后检测HL的活性，前后相减即得LPL的活性。,第四部分 抗动脉粥样硬化药物筛选,七、调血脂药及抗AS药筛选,1. 用正常动物初筛 正常动物的血脂较低，HDL比例较高，与人体有差异。但所测结果与临床基本一致，故正常动物筛选也有一定价值。 正是由于正常血脂动物对药物的敏感性较低，若能取得阳性结果常较可靠。,第四部分 抗动脉粥样硬化药物筛选,七、调血脂药及抗AS药筛选,2. 用动物病理模型筛选 (1)动物病理模型的建立 常用动物：鹌鹑、兔、猕猴、大鼠、小鼠和贵州小型猪 a. 喂养法 以高Ch和脂类饲料喂养动物以形成实验性脂代谢紊乱和AS病变，较常用。喂养数周可呈现明显的脂代谢紊乱，数月形成早期的AS病变（兔、鹌鹑、鸡）。但大鼠、小鼠等较难形成。,第四部分 抗动脉粥样硬化药物筛选,七、调血脂药及抗AS药筛选,2. 用动物病理模型筛选 (1)动物病理模型的建立 a. 喂养法 饲料中加蛋黄粉、胆盐和猪油等，可促进脂代谢紊乱； b. 表面活性剂法 大鼠ip.Triton WR1339，9h后血清Ch升高3倍，TG升高最强，但不易形成实验性AS病变。,第四部分 抗动脉粥样硬化药物筛选,七、调血脂药及抗AS药筛选,2. 用动物病理模型筛选 (1)动物病理模型的建立 a. 喂养法 b. 表面活性剂法 c. 免疫性方法 给兔注射大鼠主动脉匀浆，可引起血Ch、LDL、TG升高；注射马血清，动脉内膜损伤率为88%，呈AS病变； 同时给予高Ch饲料，病变更明显。,第四部分 抗动脉粥样硬化药物筛选,七、调血脂药及抗AS药筛选,2. 用动物病理模型筛选 (1)动物病理模型的建立 a. 喂养法 b. 表面活性剂法 c. 免疫性方法 d. 注同型半胱氨酸法 e. iv Ch-脂肪乳法 f. 注蛋黄乳法 g. 果糖致高TG血症法,第四部分 抗动脉粥样硬化药物筛选,七、调血脂药及抗AS药筛选,3. AS模型的病变检测 (1) 动脉内皮损伤和功能改变的检测 a. 内皮损伤后的内膜反应 剥取内膜制成匀浆，用二苯胺法测定DNA或进行组织性检查内膜增生。 b. 内皮功能的测定 测定药物对主动脉损伤及其对Ach的内皮依赖性松弛的效应。以离体主动脉条的收缩作为检测指标。,第四部分 抗动脉粥样硬化药物筛选,七、调血脂药及抗AS药筛选,3. AS模型的病变检测 (1) 动脉内皮损伤和功能改变的检测 a. 内皮损伤后的内膜反应 b. 内皮功能的测定 c. 主动脉斑块和冠状动脉病变的分级 肉眼观察主动脉斑块，固定后苏丹染色，斑块呈红色再行观测。还可称重，计算斑块面积或重量占动脉壁的百分率，按分级判断药物的作用。,第四部分 抗动脉粥样硬化药物筛选,七、调血脂药及抗AS药筛选,3. AS模型的病变检测 (1) 动脉内皮损伤和功能改变的检测 a. 内皮损伤后的内膜反应 b. 内皮功能的测定 c. 主动脉斑块和冠状动脉病变的分级 d. 动脉内膜及中膜的观测 光镜、电镜检测，还可通过内膜及中膜厚度的比值，内膜泡沫细胞数的观测及中膜完整平滑基层数来定量观测。,第五部分 抗高血压药物筛选,一、实验性高血压模型,1. 肾性高血压模型 模型评价： 病理生理与人类高血压相似； 手术简便； 高血压稳定，对降压药物的反应与病人相符。 适用于抗高血压药物筛选和疗效评价。,第五部分 抗高血压药物筛选,一、实验性高血压模型,1. 肾性高血压模型 (1) 肾血管性高血压模型 也称肾动脉狭窄性高血压模型，分为2肾1夹型（一侧肾动脉狭窄）和2肾2夹型（两侧肾动脉狭窄）。 常用狗和大鼠。 原理：狭窄肾动脉可造成肾脏缺血，导致肾脏内肾素合成和分泌增多，进而增加血中血管紧张素含量，BP升高 方法：手术套环使肾动脉狭窄,第五部分 抗高血压药物筛选,一、实验性高血压模型,1. 肾性高血压模型 (1) 肾血管性高血压模型 (2) 肾外包扎性高血压模型 也称肾外压迫性高血压模型，可分为2肾1扎型（一侧肾包扎）、1肾1扎型（一侧肾切除，另一侧肾包扎）和2肾2扎型（两侧肾动包扎）。 常用大鼠 原理：肾外异物包扎，可致肾周围炎，在肾外形成一层纤维素性鞘膜，压迫肾实质，造成肾组织缺血，肾素 方法：手术分离肾脏，绕肾门将肾脏交叉包扎，收缩压可升高50%以上,第五部分 抗高血压药物筛选,一、实验性高血压模型,2. 内分泌性高血压模型 (1) DOC盐性高血压模型 去氧皮质酮(DOC)为盐皮质激素，具有明显的水钠潴留作用，使细胞外液增加，BP。 大鼠一侧肾切除后，皮下注射DOC持续性高血压 (2) 肾上腺再生性高血压模型 幼年大鼠左侧肾和肾上腺切除，右侧肾上腺包膜切开，去除肾上腺髓质和大部分皮质。术后饮用1%氯化钠溶液，2周后血压明显升高。,第五部分 抗高血压药物筛选,一、实验性高血压模型,3. 神经原性高血压模型 神经系统参与血压的调节，可通过影响神经系统来制造高血压模型。 但应用并不普遍。去窦弓神经（SAD）动物（狗、兔、大鼠）常用于减压反射和血压波动性的实验研究。,第五部分 抗高血压药物筛选,一、实验性高血压模型,4. 遗传性高血压模型 通过遗传学的方法制造的高血压模型称为遗传性高血压模型。 (1) 选择性近亲繁殖高血压模型 a. 自发性高血压大鼠 从几百只Wistar京都种大鼠中筛选出一只收缩压持续在150175 mmHg的雄性大鼠，与收缩压为130140 mmHg的雌性大鼠交配，再选用血压较高的大鼠进行近亲交配，20代后可获得稳定的高血压遗传性。,第五部分 抗高血压药物筛选,一、实验性高血压模型,4. 遗传性高血压模型 (1) 选择性近亲繁殖高血压模型 a. 自发性高血压大鼠 b. Dahl盐敏感大鼠：高盐饮食 c. 米兰种高血压大鼠 d. 遗传性高血压大鼠：新西兰种高血压大鼠 e. 以色列种高血压大鼠 f. 里昂种高血压大鼠,第五部分 抗高血压药物筛选,一、实验性高血压模型,4. 遗传性高血压模型 (1) 选择性近亲繁殖高血压模型 (2) 基因工程高血压模型 分两类： 采用转基因技术将外源基因随机整合到动物基因组中并过分表达造成高血压，称高血压转基因动物； 采用基因打靶技术将动物内源基因定向敲除造成高血压，称高血压基因敲除动物。 该模型所需技术和实验室要求高，且与多基因遗传的人类高血压病有差异。,第五部分 抗高血压药物筛选,二、血压测定法,1. 直接测压法 将导管一端直接插入动脉中，另一端连至各种检压计以测定血压。采用压力换能器，将压力信号转变为电信号，经放大系统记录在生理记录仪或计算机上。 (1) 麻醉动物直接测压法 动物麻醉后，动脉插管连接于压力换能器。记录血压在生理记录仪上。股静脉给药，观察药物对动物血压的影响。 评价：动物呼吸和麻醉深度对血压影响很大。 本实验用于急性实验。,第五部分 抗高血压药物筛选,二、血压测定法,1. 直接测压法 (1) 麻醉动物直接测压法 (2) 清醒动物直接测压法：大鼠常用 a. 简易法：特制的动脉导管。 动物氯胺酮麻醉后进行手术，从股动脉插入动脉导管，由金属引针经背部皮下穿过从头顶部剪开引出，导管最后插入腹主动脉，连接测压系统检测血压。动物清醒后，股静脉给药，观察药物对动物血压的影响。 评价：动物为清醒状态，活动不受抑制； 可进行急性实验和慢性实验（维持时间有限）。,第五部分 抗高血压药物筛选,二、血压测定法,1. 直接测压法 (1) 麻醉动物直接测压法 (2) 清醒动物直接测压法：大鼠常用 a. 简易法 b. 计算机化合和遥控测定技术 动物体内植入微型压力发送器，连续感受、处理和发送信号; 接收器，固定在动物笼内，检测压力发送器的发送信号，输入计算机； 计算机记录处理系统,第五部分 抗高血压药物筛选,二、血压测定法,2. 间接测压法 (1) 容积测压法 a. 大鼠尾容积测压法 大鼠尾根部加压超过收缩压时，血流中断，当压力逐渐降低到等于或稍低于收缩压时，血液流入尾部，此时压力大于静脉压，血液回流受阻，尾容积加大，测定该容积突然增加时的瞬间压力，即为收缩压。 水容积法和光电容积法,第五部分 抗高血压药物筛选,二、血压测定法,2. 间接测压法 (1) 容积测压法 a. 大鼠尾容积测压法 b. 大鼠足容积测压法 原理同上，采用光电容积法测定容积改变。 (2) 脉搏测压法 a. 大鼠尾动脉脉搏测压法 大鼠尾根部加压超过收缩压时，脉搏消失，压力减至收缩压时，脉搏出现，继续减压至舒张压时，脉搏恢复加压前水平，检测脉搏变化时的瞬间压力即得血压值。,第五部分 抗高血压药物筛选,二、血压测定法,2. 间接测压法 (1) 容积测压法 a. 大鼠尾容积测压法 b. 大鼠足容积测压法 (2) 脉搏测压法 a. 大鼠尾动脉脉搏测压法 b. 狗颈动脉脉搏测压法 c. 狗尾动脉脉搏测压法 a, b, c 测压方法有脉搏描记法，脉搏听诊法等,第六部分 抗心功能不全药物筛选,心功能不全动物模型，可分为： 压力超负荷引起的心功能不全， 血容量超负荷引起的心功能不全， 化学因素引起的心功能不全等。 不同类型的心功能不全，有不同的测量指标衡量，一般可分为泵功能指标与心肌收缩性指标两类。,第六部分 抗心功能不全药物筛选,泵功能指标与心肌收缩性能指标,泵功能指标： 心输出量，心脏指数，心搏指数，射血分数 心肌收缩性能指标： dp/dtmax，VCE，Vmax， 超声微测距技术测定心肌节段收缩,第六部分 抗心功能不全药物筛选,一、心肌收缩功能的超声微测距技术,超声测距法是利用超声微测距仪测定心肌或类似组织长度变化的方法，通过连于组织的成对超声探头，以探头间的距离变化反映组织的 长度变化。 动物：兔、羊、狗等 在心血管系统，超声定量测定技术主要用于心肌段长测定，室壁厚度测定，心脏内外径测定以及血管口径大小的测定等方面。,第六部分 抗心功能不全药物筛选,一、心肌收缩功能的超声微测距技术,探头的种类较多，植入式探头，缝贴式探头等。 缝贴式探头直接缝于心外膜，植入式探头须植入心肌组织中。 可用于急性动物实验或慢性动物实验。后者在手术时将各种探头导线引至动物背部，待动物清醒恢复一段时间后进行记录。 特点：精密度高；可埋藏超声晶体于动心肌内，作动态观测和较长时间慢性实验；但探头放置位置应精准。,第六部分 抗心功能不全药物筛选,二、心脏压力超负荷心功能不全模型,造成心脏压力超负荷常见原因是高血压和心室血液流出道受阻，如主动脉、肺动脉缩窄或造成半月瓣狭窄均可加重心脏后负荷。建立该模型的关键在于控制血管缩窄程度。 主动脉狭窄法 主动脉狭窄造成左室血液流出道受阻，左室后负荷加重，心脏首先动用代偿机制如心肌肥厚等，而左室肥厚不一定发生心衰，但当心脏失去代偿能力时即可产生心衰。 该模型易发生心衰，重现性好，造价低。与临床症状相似.,第六部分 抗心功能不全药物筛选,二、心脏压力超负荷心功能不全模型,主动脉狭窄法 2. 肺动脉狭窄法 缩窄肺动脉右心排血障碍，右室后负荷增加，右室肥厚，长期发展可发生心衰。由于右室后负荷加重，右室不能使体循环回心血量排至肺循环中，故右心衰竭时主要表现为体循环血量增加和静脉系统压力增高，导致内脏器官和肢体静脉及毛细血管淤血、水肿。,第六部分 抗心功能不全药物筛选,三、心脏血容量超负荷心功能不全模型,心脏血容量超负荷常见原因是主动脉瓣或二尖瓣关闭不全、肺动脉瓣或三尖瓣关闭不全、房间隔、室间隔缺损及动、静脉短路等。 造成动物心脏血容量超负荷常用的实验方法是腹主动脉与下腔静脉吻合以形成动、静脉短路。通过血管结扎或血管内气囊缩窄下腔静脉等方法。 该模型造成心脏前负荷增加，造成心室舒张末期容积增加，持续发展导致心室扩大肥厚、心力衰竭。,第六部分 抗心功能不全药物筛选,三、心脏血容量超负荷心功能不全模型,动、静脉短路法 2. 腔静脉缩窄法 3. 主动脉瓣与二尖瓣关闭不全法 从颈总动脉插管至心脏，导管插到主动脉瓣处反复用力损伤主动脉瓣瓣膜，造成主动脉瓣冠脉不全。 在左心房剪一小口，通过小口从二尖瓣瓣膜顶端破坏二尖瓣造成二尖瓣冠脉不全。,第六部分 抗心功能不全药物筛选,四、化学物质产生心功能不全模型,抑制心脏药物损伤心功能模型 具有负性肌力作用的药物可抑制心肌收缩性能。如-受体拮抗剂普萘洛尔、钙通道阻滞剂维拉帕米、I型抗心律失常药普鲁卡因胺和中枢抑制药戊巴比妥等可严重抑制心肌功能而致心衰。 在狗心室肌外膜下植入超声晶体，采用先静注后静滴普萘洛尔或维拉帕米，造成心衰，测定心肌收缩力、心输出量、左室功能等指标，评价药物的作用。,第六部分 抗心功能不全药物筛选,四、化学物质产生心功能不全模型,抑制心脏药物损伤心功能模型 2. 阿霉素心肌病动物模型 阿霉素具有严重的心脏毒性，发生率与程度同人体内阿霉素的蓄积量有直接关系。故建立阿霉素心肌毒性的急性及慢性模型。 阿霉素给药后数小时至数天，动物即可出现急性心肌中毒的表现；单次或多次给药后长期观察，可建立阿霉素慢性心肌毒性模型即心肌病模型，动物出现心肌病后损害加重进一步发展为心力衰竭。,第六部分 抗心功能不全药物筛选,四、化学物质产生心功能不全模型,抑制心脏药物损伤心功能模型 2. 阿霉素心肌病动物模型 3. 电解产生氧自由基损伤心功能模型 在生理灌流液中放入两个电解电极，电解灌流液产生氧自由基，随灌注液立即进入冠脉和心肌细胞，引起蛋白自由基和脂质自由基等的产生，共同造成脂质过氧化，破坏蛋白结构与功能，引起心脏功能及生化指标的改变。,第六部分 抗心功能不全药物筛选,四、化学物质产生心功能不全模型,抑制心脏药物损伤心功能模型 2. 阿霉素心肌病动物模型 3. 电解产生氧自由基损伤心功能模型 4. 自由基引起的心功能不全模型 离体Langendorff灌流心脏，灌流液中加入自由基产生反应底物，产生超氧阴离子、羟自由基或硝基自由基，模拟心肌缺血再灌注损伤过程中产生大量活性的自由基，使膜脂质过氧化，损害心肌的超微结构，线粒体肿胀等病理损害，测定心肌收缩力、LVP、LVEDP、LDH、CPK、冠脉流量等指标。,第六部分 抗心功能不全药物筛选,五、拟似冠心病高血压的心衰模型,在结扎动物左冠状动脉前降支而产生心肌梗死的基础上逐渐缩窄升主动脉，以增加心脏后负荷而造成心衰。手术69天后，活动明显减少，四肢逐渐出现水肿，活动时呼吸困难，耳、唇发绀等。测定心功能指标发现，心输出量降低，LVEDP升高，非缺血区心肌节段收缩显著降低，解剖可发现全心及左室肥大。 特点： 1. 该模型与临床冠心病伴高血压性心衰相似。 2. 方法可靠，已知抗心衰药物在此模型上有效。 3. 缺点是动物死亡率较高。,第七部分 影响微循环药物筛选,微循环实验方法可用于研究某些重大疾病的微循环障碍及治疗药物如丹参、川芎嗪等的作用。,微循环药物实验方法主要用于研究微血管、微血流及微血管周围组织的动态变化，探讨药物作用.,微循环实验方法较多： 形态学观察； 活体微循环观察； 血液流变学方法等,第七部分 影响微循环药物筛选,一、微循环动物实验方法-活体,活体观察是微循环药理研究的重要方法，可直接观察药物对用药局部及全身微循环的影响。分两大类： 体表微循环实验方法，观察皮肤、粘膜、眼球结膜等； 内脏微循环实验方法，观察心、脑、肺、肾、肝等。 动物选择：大鼠、小鼠、中国地鼠、金黄地鼠、兔、猫、狗等 需要设备：显微摄影、显微电视系统、显微照相装置等,第七部分 影响微循环药物筛选,一、微循环动物实验方法-活体,观察指标： 1. 微血管管径；2. 毛细血管网交点计数； 3. 微血流速度；4. 微血管自律运动； 5. 微血流流态，按流态分级可半定量血流速度。 如线流，线粒流，粒线流，粒流，粒缓流 6. 血色：了解微循环障碍程度及药物的影响 7.其他病理改变：渗出、出血、微小血栓等,第七部分 影响微循环药物筛选,一、微循环动物实验方法-活体,常用方法： 1. 头部器官微循环观察 眼球结膜，虹膜，眼底，鼻粘膜，口唇等，用普通显微镜放大40100倍即可观察。 2. 兔眼球结膜微循环检查 3. 大鼠肠系膜微循环观察法 4. 肺活体微循环观察法 5. 闭合式颅窗法观察软脑膜微循环和微血流,第七部分 影响微循环药物筛选,二、微循环测压和测流速,微循环压力变化直接反映体循环功能是机体微循环的一项重要指标。 用微穿刺技术可成功测出微血管压力，但需高精度配套仪器，技术难度大。 1. 指动脉间接测压法