趋化因子.ppt

趋 化 因 子 研 究 进 展 北京大学医学部 韩 文 玲,简 介,目前，近50种趋化因子得以发现，成为最大的细胞因子亚家族; 趋化因子及其受体具有重要的生理意义和病理作用,在炎症、肿瘤、AIDS等疾病中发挥重要作用，趋化因子相关产品已经进入临床研究，成为新的生物治疗热点; 趋化因子的理论和应用研究是目前生命研究的热点之一。,趋化因子研究的迅速发展,趋化因子研究的标志性成果,一、趋化因子,（一）概念： 趋化因子（chemokines, chemoattractant cytokines ，CK）是能使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子。趋化运动是指细胞向高浓度刺激物方向的定向运动。,（二）命名,早期：根据CK来源、靶细胞、结构特征而命名。 TARC：Thymus and Activation Regulated Chemokine 胸腺和活化调节的趋化因子 STCP-1 /MDC: Stimulated T Cell Chemoattractant Protein-1 （活化T细胞趋化蛋白-1 ） Macrophage-Derived Chemokine （巨噬细胞来源的趋化因子）；,1999年，国际命名委员会根据CK的结构特征命名。 绝大多数CK有4个保守的半胱氨酸（Cys），根据前两个Cys的相对位置不同，可以分为CXC（） 、CC（） 、C（） 和CX3C（） 趋化因子。 分别用CXCLn、CCLn、 XCLn和CX3CLn代表CXC、CC、 C 和CX3C家族CK ，L为Ligand，迄今发现的CK有CXCL1-16， CCL1-28， XCL1-2和CX3CL1。 CCL17/TARC， CCL22/STCP-1/MDC CK基因的命名:SCYn: Small Inducible Cytokine Gene SCYAn:CC; SCYBn:CXC; SCYCn: C; SCYDn: CX3C。 CK受体的命名规则与此相似，用R即Receptor代替L。 目前发现的CK受体有CCR1-11，CXCR1-6，XCR1和CX3CR1。 ,（三）趋化因子的分类,1、根据蛋白质的一级结构进行分类： CXC （）趋化因子； CC （）趋化因子； C （）趋化因子； CX3C （）趋化因子。,C为半胱氨酸,X为任意氨基酸,（1）CXC（）趋化因子,根据该家族CK第一个Cys前是否有ELR（glutamic acid-leucine-arginine,谷氨酸-亮氨酸-精氨酸）结构，分为： ELR CXC趋化因子: ELRCXCCC CXCL8/IL-8 等， 趋化Neu，不能趋化Mo；促进血管的生成。 非ELR CXC趋化因子: CXCCC CXCL12/SDF-1等， 趋化Lymphocyte或HPC；抑制血管的生成。 同源性： CXC家族CK之间 ：25%-90%。 染色体定位： CXCL1-11：4q21；CXCL12：10q11；CXCL13：5q31,CXC趋化因子的名称、染色体定位及受体,（2） CC （）趋化因子,分 类：4Cys CC趋化因子:包括多数CC CKs CCCC 6Cys CC趋化因子: CCL15/Lkn-1，CCL21/SLC/6Ckine CCCCCC 趋化谱：T、B、Mo、Bas、Eos、Neu等。 同源性：CC成员之间：25%-70%； 定 位：CCL1-16,18,23: 17q11-12; CCL17,22:16q13; CCL19,21,25,27:9p13,CC趋化因子的名称、染色体定位及受体,CC趋化因子在17号染色体上成基因簇形式存在,（3）C（）趋化因子,结 构：CC (2，4位Cys) Ltn1，2 (lymphotactin，淋巴细胞趋化素)两个成员， 趋化谱：T，BMC 定 位：1q23,(4)CX3C （）趋化因子,结 构：CXXXCCC Fractalkine/neurotactin: 分形素/神经 趋化素，唯一一个CX3C成员，为膜结合型 CK。 趋化谱：膜型:Mo,T; 重组的趋化因子功能区:Neu。 定 位：16q13，与CCL17,22紧密连锁。,2、根据来源和功能分类：,（1）组成性/淋巴组织/自稳性趋化因子： 定 义：胸腺、淋巴结、脾脏中组成性高表达的CK。 靶细胞：初始T细胞、胸腺细胞、记忆细胞。 功 能：在淋巴细胞的发育、成熟、归巢和再循环过 程中发挥重要作用。 皮肤、小肠、粘膜组织中也表达此类CKs，与组织特 异性淋巴细胞归巢有关。,自稳性趋化因子的组织表达,（2）诱导性表达趋化因子/炎性趋化因子： 定 义：在LPS、IL-1、TNF-等刺激下产生的CK 。 靶细胞：效应细胞。 功能：防御功能；反应过度时，有破坏作用。,趋化因子的表达模式,炎性趋化因子和自稳性趋化因子成员、受体及靶细胞,（3）其它具有趋化活性的细胞因子,IGF-1,FGF,HGF等细胞因子具有趋化活性，但它们的主要作用不是趋化作用，不列为CKs。,1、CKs分子量小，在8-12KD之间； 2、蛋白质一级结构上具有同源性，CXC与CC 成员之 间：20%-30%；,（四）趋化因子的共同结构特点,3、多数CKs含有4个保守的Cys ，1，3位Cys、 2，4位 Cys形成功能必须的两对二硫键；,4、CKs有2个螺旋，3个折叠；,CXCL12/SDF-1的空间构型图（NMR）,5、不同CKs具有相似的空间结构。,趋化因子的结构、定位及组成,二、趋化因子受体,趋化因子受体属于7次跨膜的G蛋白 偶联受体超家族（GPCRs，G-protein coupled receptors）,1、7次跨膜，C端位于胞内，有Ser/Thr位点，参 与信号转导；,(一) 趋化因子受体的特点,2、不同CKR之间具有同源性；,3、胞内区与G蛋白偶联，G蛋白由组成； 4、亚单位具有GTP结合位点和GTP酶活性； 5、CKR未与CK结合时，呈聚合状态，与GDP结合； 与CK结合后， 与GTP结合，游离，活化下游效应物.,6、与CKR偶联的G蛋白有多种，与趋化运动有关的 G蛋白亚单位多为PTX敏感的GI。,（二）、趋化因子受体的分类 1、根据结合配体的不同，分为CXCR， CCR， XCR, CX3CR。 2、根据特异性不同，分为特异性受体、共享性受体、杂合性 受体（DARC，Duffy血型抗原，红细胞趋化因子受体）、 孤儿受体、病毒受体等。,（三）、趋化因子受体的表达 1、CKR有其相对特异的表达谱： CXCR4： Neu、Mo; CCR3: Eos、Bas； DARC：RBC,趋化因子受体、配体及靶细胞,2、CKR的表达具有时、空特异性： （1）在Th细胞的不同阶段，表达不同的CKR： Nave Th:CCR7, CXCR4; Th0: CCR7, CCR5, CXCR3 Th1: CCR5, CXCR3; Th2:CCR3,4,8, CXCR4,（2）CKR在DC迁移和功能成熟中具有不同的表达模式: 非成熟DC：CCR1，CCR2，CCR5， CXCR4， 易于向炎症部位聚集，摄取抗原 负载抗原的成熟DC：CCR4，CCR7，CXCR4， 便于向淋巴组织迁移,TLR调控DC细胞CKR的表达,(四)CKR的信号传导途径,IL-8+IL-8R,GDP,GTP. ,TPK,PLC2,3 PI-3K,IP3 + DAG,Ca2+,PKC,PKB,MAPK,CKR的信号传导途径,三、趋化因子的基本功能,（一）趋化作用； （二）上调整合素的表达, 活化白细胞； （三）促进细胞脱颗粒和生物活性物质释放: CCL2/MCP-1：Bas释放组织胺； CXCL8/IL-8：Neu产生活性物质，呼吸爆发； （四）调节血管生成： ELRCXC 、CCL2促进血管生成；CXCL10 、CCL21/SLC抑制血管生成。,趋化因子引起的细胞形态改变,趋化因子在白细胞迁移中的作用,CXCL8/IL-8的作用,（五）生长因子活性，促进细胞增殖,四、趋化因子在免疫细胞 发育、定位及免疫应答中的作用,（一）CKs促进免疫细胞发育、成熟： 1、 CXCL12/SDF-1和CXCR4促进B细胞分化发育成熟； 2、CCL25/TECK和CCR9、 CXCL12/SDF-1和CXCR4、 CCL22/MDC和CCR4等促进T细胞发育成熟； 3、CCL3，4/MIP-1、和CCR1，CCR2，CCR5等促进非成熟DC 向炎症部位聚集，摄取抗原，发生功能成熟。,CXCL12/SDF-1和CXCR4促进B细胞分化发育成熟,HPC表达CXCR4，骨髓基质细胞产生CXCL12/SDF-1； CXCL12/SDF-1趋化HPC与基质细胞相互作用， 促进HPC向B细胞发育，表达sIg； 成熟B细胞对CXCL12/SDF-1反应性 ，离开骨髓，进入血循环,CCL25/TECK和CCR9、 CXCL12/SDF-1和 CXCR4、CCL22/MDC和CCR4等促进T细胞发育成熟,CCL22/MDC和CCR4促进DP与TEC作用， 发生阴性选择或成熟为单阳性细胞进入外周,胸腺中表达的CK和CKR,CCL3，4/MIP-1、和CCR1，CCR2，CCR5等促进DC成熟,(二） CCL21/SLC，CCL19/ELC和CCR7、CXCL13/BCA-1/BLC和CXCR5 协助T、B、DC细胞在周围免疫器官中正确定位并相互作用,T： CCR7; DC：CCR7; B： CCR7 、CXCR5; TFH：CXCR5 T区HEV：SLC、ELC; B滤泡区HEV：BCA; T与DC在T区作用，分化效应细胞; TFH与B在B区作用，协助Ab产生和类别转换,（三）促进效应T细胞回到炎症和感染部位,1、TFH：CXCR5，进入滤泡区，辅助B细胞产生抗体 的类别转换； 2、Th1: CCR5, CXCR3，进入病毒感染等炎症部位； 3、Th2:CCR3,4,8, CXCR4，进入过敏反应部位。,病原体决定免疫应答,（四）CKs促进天然免疫细胞和 活化的适应性免疫细胞相互作用,1、CKs使Th2活化与组织Eso聚集相联系； 2、CTL活化，产生CKs，Mo、NK、Granulocyte聚 集，扩大杀伤效应。,趋化因子与过敏反应中嗜酸细胞聚集,Th2细胞分泌的IL-4、IL-13与IL-1、TNF协同作用，促进 Eotaxins-1,2,3、MCP-4产生，趋化Eos、Bas。,CTL产生趋化因子 白细胞聚集病毒感染部位，放大免疫反应,（五）CKs协助记忆、效应T、B细胞向特定组织归巢 CLA+ T向皮肤归巢： CCL27 / CTACK、 CCR10， CCL17/TARC、CCR4 47hi T向小肠归巢： CCL25 / TECK、CCR9 IgA ASC向小肠粘膜归巢： CCL25 / TECK、CCR9 IgG ASC位于慢性炎症部位： CXCL9 / Mig 、 CXCR3， CXCL12 / SDF-1 、 CXCR4 T向粘膜归巢：CCL28 / MEC。,趋化因子及其受体在免疫应答中的作用,五、趋化因子调节造血,（一）趋化造血前体细胞，调节骨髓造血功能： MIP-1 /CCL3、MCP-4/CCL13、TECK/CCL25等25种CKs抑制 髓系造血； 人MIP-1/CCL3与GM-CSF和M-CSF协同刺激骨髓造血； （二）促进B前体细胞的发育：SDF-1/CXCL12； （三）促进Eos前体细胞发育成熟：Eotaxin/CCL11。,六、趋化因子的常用研究方法,（一）趋化实验 ： 1、体内实验：皮下、腹腔、静脉注射，观察细胞 浸润情况；繁琐。 2、体外实验：最常用的方法是Boyden小室法，也称微孔滤膜 法。48孔趋化小室，上层放靶细胞，下层放待检测因子，两 层之间有聚炭膜隔开；简单易行。 细胞类型 膜孔径 趋化时间 Neu: 3um 30min； Lymphocytes: 5um 120min； Mo: 8um 90min,反应结束后，洗掉非特异结合细胞，固定、染色，记数。 记数方法： 高倍镜下每孔随机选5个视野，取平均值。 趋化活性表示方法： 通常以趋化指数（chemotatic index, CI）表示。 CI指实验组细胞数与对照组细胞数（三个复孔 的平均值）的比值，CI大于2有意义。,Boyden小室示意图,A、微孔滤膜法示意图 B、内皮细胞趋化结果,（二）钙流实验,多数CK与受体结合后, 胞内Ca2+ ； Indo-1 AM或Fura-2 AM等是Ca2+螯合剂EGTA的衍生物，可特异高亲和Ca2+； 将靶细胞与荧光探针孵育； 检测荧光强度变化，反映CK活性。,（三）功能实验,CXC CKs:弹性蛋白酶、葡萄糖醛酸酶释放检测、呼吸 爆发实验； MIP-1，：用骨髓造血干细胞集落形成实验； CC CKs:组织胺释放。,七、新趋化因子cDNA的克隆技术,(一)早期CKs：蛋白质到核酸；费时耗力,CXCL8/IL-8。 (二)新发现CKs：核酸到蛋白质；快速。,1、CKs产生细胞cDNA的大规模测序和生物信息学分析,CKs产生细胞cDNA文库大规模随机测序同源性比较与已知CKs有同源性的克隆全长cDNA克隆化表达活性筛选鉴定 CCL23/MPIF-1:动脉内皮细胞cDNA文库大规模随机测序，发现其编码氨基酸与MIP-1有51%的同源性，昆虫细胞表达蛋白具有趋化T、Mo细胞的活性。,2、染色体中免疫分子聚集区的大规模测序,17号染色体存在CC Cluster，对YAC克隆测序、分析，克隆了CCL18/MIP-4,与MIP-1有49.5的同源性，趋化T细胞。,3、差异显示技术克隆细胞因子,同一细胞在不同条件下表达的免疫分子不同，利用DD-PCR、RDA、SSH等技术克隆新细胞因子。 例：本实验室克隆的CKLF1: IL-10抑制细胞因子产生，利用SSH技术克隆U937细胞中被IL-10抑制的cDNA，发现新的细胞因子CKLF1（Chemokine-like factor 1），CKLF1具有趋化效应，促进骨髓细胞集落形成效应和刺激骨骼肌细胞效应。,4、Blast检索及EST分析和拼接,例1：从公共的EST数据库发现CCL26/ MIP-4, 与MIP-1有44的同源性，趋化T、Mo。 例2：本室大鼠CKLF1，2、小鼠CKLF2，4及人CKLF-RP1-8(CKLF-Related Protein 1) 的克隆化。,八、 总 结,（一）CKs概念、命名、分类、结构特点： 1、概念：是能使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子。 趋化运动是指细胞向高浓度刺激物方向的定向运动。 2、命名： CKs： CXCLn、CCLn、 XCLn、CX3CLn CK基因：SCYAn:CC; SCYBn:CXC; SCYCn: C; SCYDn: CX3C。 CK受体：CXCR1-6， CCR1-11，XCR1和CX3CR1。 3、分类：（1） CXC （）：ELR和非ELR；CC （）：4C和6C； C （）；CX3C （）。 （2）组成性/淋巴组织/自稳性趋化因子； 诱导性表达/炎性趋化因子。,4、 CKs的结构特点： （1）CKs分子量小，在8-12KD之间； （2）蛋白质一级结构上具有同源性； （3）多数CKs含有4个保守的Cys，1，3位Cys、 2，4 位Cys形成功能必须的两对二硫键； （4）CKs有2个螺旋，3个折叠； （5）不同CKs具有相似的空间结构。,（二）CKR结构特点、 分类、表达及信号转导,1、结构特点： （1）7次跨膜，C端位于胞内，有Ser/Thr位点，参与信 号转导； （2）不同CKR之间具有同源性； （3）胞内区与G蛋白偶联，G蛋白由组成； （4）亚单位具有GTP结合位点和GTP酶活性； （5）CKR未与配体结合时，呈聚合状态，与GDP结 合；与CK结合后， 与GTP结合，游离，活化下 游效应物. （6）与CKR偶联的G蛋白有多种，与趋化运动有关的G蛋 白亚单位多为PTX敏