淀粉酶的专一性和温度、pH、激活剂

实验九 淀粉酶的专一性和温度、pH、激活剂及抑制剂对酶活性的影响实验类型：验证型目的和要求1.通过本实验观察、验证酶的专一性和温度、pH、激动剂及抑制剂对酶活性的影响。2.熟悉淀粉及其酶解产物的特殊显色方法；电热恒温水浴的使用。 3.了解唾液淀粉酶的收集与预处理。原理酶具有高度专一性，一种酶只能催化一种或一类底物发生反应，如淀粉酶只能水解淀粉，不能水解蔗糖。当淀粉被淀粉酶彻底水解为还原性麦芽糖和葡萄糖时，能使班氏试剂的Cu2+还原成Cu1+，生成砖红色Cu2O沉淀。淀粉酶的活性受温度、pH、激动剂及抑制剂、酶浓度以及作用时间等多种因素影响，因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。不同程度的水解糊精可与碘反应生成紫色、棕色或红色络合物。通过上述特征性反应，并以蔗糖等作对照，便可观察、验证淀粉酶是否具有专一性以及它的催化活性是否受到影响。操作方法一、唾液淀粉酶的收集与处理1.制备唾液实验者先将痰咳尽，用自来水漱口，以清除口腔内食物残渣，再在口腔内含蒸馏水约15ml，并作咀嚼咕漱运动，3分钟后吐入垫有两层经润湿处理的脱脂纱布的漏斗内，过滤于小烧杯中备用，为与下面稀释唾液相区别，此称制备唾液。2.煮沸唾液取上述唾液约2ml，盛入1中号试管中,置沸水浴煮沸5分钟备用。3.稀释唾液调整唾液淀粉酶活性，使之在pH6.8、37和既无激动剂又无抑制剂条件下，作用5min，水解淀粉至红色糊精为宜。具体做法是取12凹白瓷反应板一块，按下列步骤操作：第1排每凹各加1滴制备唾液，12、13、14凹分别加生理盐水1、2、3滴，用滴管采用抽吸法，由稀到浓（1412）小心混匀各凹，勿使溅入相邻凹中。每混匀一凹便取其1滴放入同列的2排凹中，剩余稀释唾液应全部放回原凹中。在盛有不同稀释度唾液的第2排各凹中，均加入4滴缓冲液（pH6.8），2滴1%的淀粉液和2滴蒸馏水，用混匀法充分混匀，置37下5min。在第2排各凹中加I液一滴，混匀，观察比较各凹颜色，以浅棕-红色对应的稀释倍数，用生理盐水稀释3ml制备唾液备用。二、唾液淀粉酶的专一性以及温度、pH、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活性影响的观察（一）取试管3支编号，按下表1操作 表1 唾液淀粉酶专一性的实验观察 试剂 试管pH6.8缓冲液1淀粉溶液1蔗糖溶液制备唾液煮沸唾液120滴10滴5滴220滴10滴5滴320滴10滴5滴将上述各管混匀后，置37水浴中保温10分钟，然后每管加入班氏试剂20滴，再放入沸水浴中煮沸约15分钟，观察各管颜色反应，并说明原因。（二）温度影响酶促反应的实验观察1.取试管3支编号，按下表2操作：表2 温度影响酶促反应的实验观察管号试剂1231.pH6.8缓冲液20滴20滴20滴2.1淀粉溶液10滴10滴10滴3.预热5min 37水浴沸水浴冰浴4.直接加入稀释唾液，立即混匀、计时5滴5滴5滴5.保温10min37水浴沸水浴冰浴2.将一、二管移入冰水浴中，待各管温度一致后速向各管加入碘液1滴，混匀后观察各管颜色的区别，并说明温度对酶促反应的影响。四、pH影响酶促反应的实验观察1. 取试管3支编号，按下表3操作：表3 pH影响酶促反应的实验观察pH4.0缓冲液pH6.8缓冲液pH8.0缓冲液1淀粉溶液稀释唾液试管120滴10滴5滴试管220滴10滴5滴试管320滴10滴5滴2.将上述各管混匀后，置37水浴中保温10分钟，然后每管加入碘液1滴，混匀后观察各管颜色的区别，并说明pH对酶促反应的影响。五、激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察1. 取试管4支编号，按下操作：表4 激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察pH 6.8缓冲液1淀粉溶液蒸馏水0.9NaCl1CuSO41Na2SO4稀释唾液120滴10滴10滴5滴220滴10滴10滴5滴320滴10滴10滴5滴420滴10滴10滴5滴2. 将上述各管放入37水浴中保温10分钟怎么减肚子，然后每管加入碘液1滴，混匀后观各管颜色的区别，并说明激动剂和抑制剂对酶促反应的影响。注意事项1.反应试管应清洗干净，不同酶液、试剂及其滴管不能交叉混用；2.使用混合唾液，或通过预试选出合适的唾液稀释度，效果更为显著。试剂和器材一、器材1.滴管、烧杯、试管（架）及试管夹 。2.恒温水浴箱与水浴锅。3.脱脂棉、漏斗及纱布。4.白瓷反应盘二、试剂1.1淀粉 称取淀粉1g，岳阳家政加少量水调成糊状，加入煮沸的0.3NaCl溶液至100m1。2.1蔗糖溶液3.班氏试剂 A液：取柠檬酸钠173，无水碳酸钠100，加水600ml，加热溶解，冷却后稀释至850ml；B液：取结晶硫酸铜（CuSO45H2O）17.3溶于100ml预热的蒸馏水中，冷却后加水至150ml。将A液缓慢倒入B液中混匀置试剂瓶备用。4.碘液：称取碘4g、碘化钾6g溶于l000ml蒸馏水中，置棕色瓶内贮存备用。5.各种pH缓冲液pH6.8缓冲液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液772ml，0.1mol/L怎么减肚子柠檬酸溶液228ml混合即成。 pH4.0缓冲液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液385.5ml，0.1mol/L柠檬酸溶液614.5ml混合即成。 pH8.0缓冲液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液972ml，0.1mol/L柠