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制药工艺学 基因工程制药概述,2,基因工程制药基本概念,中心法则 核酸与核苷酸 基因与DNA、RNA 氨基酸与蛋白质 转录与翻译 3与5,3,从细胞到碱基对,4,中心法则,D N A,R N A,蛋白质,复制,复制,转录,逆转录,翻译,调控,调控,遗传信息流,调控,Jun Zhang, Patrick R Griffin, et.al,. Nature Structural & Molecular Biology (2011) doi:10.1038/nsmb.2046,5,中心法则,6,中心法则,7,中心法则,8,核苷酸的3和5端,9,基因到蛋白质,10,DNA和RNA比较,组成主干的 糖类分子 2-脱氧核糖 磷酸 核糖 磷酸,骨架结构 双股螺旋 单股螺旋,核苷酸数 1000,000 3009，000,碱基种类 ATCG AUCG 有少部分例外,五碳糖连接 的组分 H OH 五碳糖的第二个碳原子上的,DNA,RNA,说明,项目,11,DNA密码子与氨基酸,.tw,12,21种氨基酸,13,氨基酸脱水成多肽,14,蛋白质,15,基因克隆的基本步骤,16,分光光度法确定细菌细胞生长情况,17,DNA浓度的测量,紫外吸收分光光度法（UV absorbance spectrophotometry） 纯净的DNA 那么，DNA的纯度可以获得,18,基因克隆中的各种酶,向共价闭合环状DNA中 引入或消除超螺旋结构,核酸酶：切开、切除 或降解核酸分子的酶,复制核酸分子的酶,将核酸分子连接起来的酶,辨认切割位点,修饰酶：添加或去除化学基团的酶,19,限制性内切酶,限制性内切酶的生物活性：（1）定位切割，形成末端 （2）降解外源DNA，但不降解自身DNA，因为在自身 酶切位点上进行甲基化保护,20,酶切结果分析：凝胶电泳,琼脂/SDS-PAGE凝胶的孔道大小决定了能够分离的DNA分子大小,21,凝胶电泳：DNA染色观察,强致癌物质,22,凝胶电泳：放射自显影,DNA聚合酶结合至DNA上,23,DNA分子大小的估计,错误率：5%,构建标准曲线,24,转化：使细菌细胞获取重组DNA,自然条件下，转化很可能不是细胞获取遗传信息的主要方式 只有极少数种类（Bacillus和Streptococcus属的成员）能够容易地被转化 绝大多数细菌，包括大肠杆菌，正常条件下，仅能获取有限数量的DNA 要高效的转化这些细菌，必须进行物理/化学处理，以增强他们获取DNA的能力 经过处理后的细胞，叫做感受态细胞,25,感受态细胞的制备,只有0.01%的DNA被转入,26,将重组DNA分子引入活细胞,27,将重组DNA分子引入活细胞,都含有抗性标记基因片段,正常情况，占绝大部分,28,将重组DNA分子引入活细胞,29,非细菌细胞的转化,将DNA引入动植物细胞的方法,30,非细菌细胞的转化,两种将DNA分子引入细胞的物理方法,31,整个植株的转化,32,整个植株的转化,制药工艺学 复习,亢阳 新浪微博：亢云开 Email：,34,学科概况,对象：工业生产过程中的共性规律及其应用 制备原理 工艺路线 质量控制 地位：药物产业化的桥梁与瓶颈 多学科性： 有机和生物化学：有机合成（含热力学）、发酵和细胞培养、基因工程 工程与工艺：工程放大、工艺设计、代谢工程 机械电子：设备设计与选型、仪表监测 经济学：经济核算与工艺优化,35,工艺研究的三个步骤,小试： 工艺路线设计与选择 反应与产物合成的动力学及其影响因素 质量控制标准与方法学 中试： 放大技术及其影响因素 工业化生产工艺研究与优化 工业生产： 工艺试验 完善生产工艺规程保证安全生产,36,化学制药工艺,特点： 安全性要求高 工艺路线尽量短 每步90%收率，那么： 3步：72% 5步：55% 7步：36% 分类： 全合成 半合成 化学合成和生物合成的杂合,37,生物技术制药工艺,以生物体或生物反应过程为基础，依赖于生物机体或细胞的生长繁殖与代谢 上游过程：获得药物。利用基因技术，细胞工程及发酵工程等进行 菌种或细胞系的选育优化 培养基优化 下游过程：产品后处理。 分离 提纯 质检和质保,38,生物技术制药发展,微生物发酵制药 酿酒 青霉素等抗生素 氨基酸、维生素等微生物代谢产物 酶工程制药：自然酶制剂 生物酶：用于制备手性药物，如酶拆分 生物催化转化，改造已有药物 细胞培养技术制药 人畜病毒疫苗、单克隆抗体、重组基因工程干扰素等,39,生物技术制药发展,基因工程技术制药 在体外通过重组DNA技术，对生物的遗传物质基因进行剪切、拼接、重新组合，与适宜的载体连接，构成完整的基因表达系统，然后导入宿主生物细胞内，与原有遗传物质整合或以质粒形式单独在细胞中繁殖，并表达活性蛋白质、多肽或核酸等药物。 也就是，通过基因工程改造微生物细胞的代谢过程，提高微生物生产抗生素、维生素、氨基酸、核酸、辅酶和甾体激素等药物的生产能力,40,作业,描述本书前两篇在目录上出现的概念，可以用例子佐证，让具备高中知识水平的人就能懂。一人一个，同学之间不能相同；如有必要，注明出处。可以使用下列工具： google Baidu wikipedia,41,反应器设计总体思路,化学反应动力学 涉及物料的物理性质 过程的质量、热量衡算 生产能力 设计：标准（国标，行业标准等）,42,反应器概述 设计,反应器选型 根据生产工艺要求、反应及物料特性等因素 确定反应器的操作方式、结构类型、传递和流动方式等 反应器结构设计 确定各种结构参数，如 几何尺寸 内部结构 搅拌器形式、大小及转速 换热方式和换热面积,43,生物反应器设计,确定工艺参数及其控制方式 温度 压力 pH 通气量 底物浓度 进料的浓度、流量等,44,反应器的分类和结构特点,根据流体流动或混合状态分类 间歇反应器（a） 连续反应器 活塞流反应器（PFR）（b）：没有返混 全混流反应器（CSTR）（c）：返混极大,45,反应器的分类和结构特点,理想反应器 非理想反应器 连续反应器 停留时间分布 微混合 轴向或径向扩（弥）散 反应器操作时的震荡 间歇反应器 混合时间 剪切力分布 各组分的浓度和温度分布,46,反应器的分类和结构特点,根据反应器结构特征及动力输入方式分类 根据反应物系特点 釜式 管式 固定床 流化床 根据动力输入方式 机械搅拌式 气流搅拌式 液体环流式,47,作业,查阅关于“发酵罐”和“搅拌釜”的相关资料，从发酵的角度看，二者的结构究竟有没有区别？如果有，有何区别？ 描述本书前两篇在目录上出现的概念，可以用例子佐证，让具备高中知识水平的人就能懂。一人一个，同学之间不能相同；如有必要，注明出处。 试用量纲分析法推导式（21-2）该式有误！,48,影响中试的因素,放大效应（scale-up effect） 因放大造成的数量和质量指标不能重复的现象，统称为放大效应 如，反应状况恶化，选择性，转化率和收率降低；产品质量不合格；甚至发生爆炸等事故 原辅料杂质 催化剂失活 环境影响生物材料或细胞的活性和稳定性 非理想化流动导致的传质和传热不均,49,中试放大研究方法,逐级放大法 完全依靠经验 相似放大法 经验，依靠量纲分析法减少试验次数 在物理过程的放大中非常有效 数学模型法 有明确的理论依据，可以高倍放大,50,工艺放大的核心,反应器放大 反应器内：“三传一反”的耦合过程 均相反应过程 扩散：宏观上的，浓度和温度分布均匀 非均相反应过程 扩散 外扩散：宏观上 内扩散：微观上 抓住过程的核心控制因素进行放大,51,工艺放大的核心,抓住过程的控制步骤进行放大 反应控制 外扩散控制 内扩散控制 建立控制步骤和工艺条件的关联 试验方法 冷模试验 本征动力学试验,52,量纲分析法,任何一个物理量都可以表示为 量纲齐次原理 正确选择相关的物理量 必需的流体力学知识 丰富的感性认识 一定的量纲分析经验,53,量纲分析法,瑞利法/定理 正确选择物理量n个 选择包含不同基本量纲的物理量，一般3-4个，他们相互独立且不能组合成一个无量纲数。 将其余物理量作为导出量，将他们分别与基本量的幂次组成无量纲数i，共（n-3，或n-4）个 写出这几个i组成的物理方程式，使之量纲齐次,54,数学模拟放大,本质：“三传一反”的数学描述及其解析 化学反应动力学模型 流体的流动模型 边界条件和初始条件 特点： 可靠性高，放大倍数大 可通过数学试验，对过程进行预测分析 模型往往复杂，建模困难，求解更难,55,数学模拟放大基础,实质是计算流体力学、热力学和动力学的耦合微分方程的联立求解 控制体积内的 质量、热量和动量衡算及 运动方程（Navier-Stocks方程） 耦合反应动力学方程 常用建模和求解工具 Ansys Fluent，CFX PHOENICS Star-CD等,56,作业,什么是KLa放大基准中的“福田秀雄修正”？ 名词解释： 连续性方程 运动方程 边界条件 初始条件,57,制药工艺计算,制药工艺图 质量衡算 热量衡算 工艺的经济性评价,58,建厂与工艺图,前期准备,初步设计,施工图设计,总工艺流程图,物料流程图,管线、各设备特征图,设备布置图,管道布置图,带控制点 工艺流程图,仪表、阀门配置，辅助管路、蒸汽管道,仪表、阀门支架、管口方向，操作平台等,带控制点 工艺流程图,59,制药工艺流程图（1）,工艺流程示意图（例：阿司匹林）,60,制药工艺流程图（2）,工艺流程简图（例：阿司匹林）,61,制药工艺流程图（3）,物料流程图：标注物料衡算结果,62,制药工艺流程图（4）,全厂总工艺流程图（物料平衡图） 在总说明部分提供的全长总流通图 细长实线画的长方框：各车间（工段） 流程线：粗实线，主要物料 流程方向：箭头 注明：车间名称，各车间原料、成品和半成品的名称、来源和去向以及相应的平衡数据,63,制药工艺流程图（5）,带控制点的工艺流程图 全部工艺设备 物料管路，阀门，设备附件 显示和控制仪表的符号 绘制方法和步骤 确定图纸幅面和绘图比例 画出设备轮廓，调整好位置，清楚好看 连接管路，标注 设备编号和名称 各种阀门、仪表和物料介质,64,常见管件与阀门符号,65,仪表安装位置及标注,66,仪表功能和被测量代号,67,计算基础和准备,收率：主要产物实际产量和理论产量之比 选择性：主产物在所有产物中所占的百分率 那么有，,68,作业,写出图22-4上各个符号的意义 计算例22-2,22-3,69,三废处理工艺,制药工业的清洁生产 制药企业的末端污染治理技术 废水处理工艺 废气处理工艺 废渣处理工艺 经济性和环境保护的综合平衡过程,70,制药工业的清洁生产,清洁生产的概念 将“整体预防”的环境战略，持续应用于产品的生产过程中，以期减少对人类和环境的风险 主要内容 清洁生产工艺 清洁产品 清洁能源,71,三废处理中的主要指标,COD BOD pH SS：suspended solids，悬浮固体含量 TN：total Nitrogen，总氮含量 TP：total Phosphorus，总磷含量,72,废水处理概要,物理化学 处理,中 和 沉 淀 混 凝 萃 取 氧 化 还 原 吸 附 过 滤 其 它,单独使用或结合使用,生物 处理,活性污泥 生物滤池 厌气法 厌气过滤 其它,单独使用或结合使用,悬浮物或剩余溶解物的处理,中和 沉淀 泡沫分离 加压上浮 氧化 还原 离子交换 电渗析 反渗透 吸附 过滤 萃取 其它,单独使用或结合使用,废水,澄清水,泥渣,污水,送回二级处理系统,回收物,综 填 合 土 利 等 用 处 或 理,循环使用 或排放,澄清水,注：引自祝传书老师课件，有修改,循环使用或排放,73,废气处理工艺,含尘废气 气固两相混合物的分离（除尘）外力（重力，惯性力，离心力等） 气相内污染物的分离 含无机污染物废气 含有机污染物废气 利用污染物的物理和化学性质，通过 冷凝、吸收，吸附，燃烧，催化等办法处理,74,废渣处理工艺,废渣 固体、半固体或浆状废物 来源复杂 处理原则 减量化、资源化和无害化 必须排出的，要综合利用 无法综合利用的，要无害化,75,作业,在“三废”处理中，物理过程通常为气-液，气-固及固-液分离，涉及到分离工程的单元操作及设备哪些？举例说明,76,化学制药概述,合成途径工艺路线 技术先进，经济合理企业竞争力 路线选择 经济性 清洁生产，“三废”问题 路线选择的基础工作 调研和论证药物及其结构类似物的文献资料 SciFinder, Belstein 有机合成技术和自身经验,77,化学反应机理,化学反应的本质 化学键的断裂和建立 化学键的本质 价层电子间稳定的相互作用 Pauling 常见有机反应的基本类型 加成 取代 消去 周环,78,有机反应的电子效应,诱导效应 共轭效应：涉及键或类似的稳定结构 超共轭效应：涉及键 推电子基（斥电子基） 拉电子基（吸电子基） 立体效应 又叫空间位阻效应，由于分子本身各个官能团客观上占据了一定的空间大小，常常成为反应的阻力,79,作业,举例说明本章出现过的56个有机人名反应。,80,常用溶剂的性质和分类,质子性溶剂,非质子性溶剂,极性,非极性,含有易取代H原子，可与含A-的 反应物由H键结合；也可与含A+ 的孤对电子配位结合；或与中性 分子中的O、N、P等原子形成H 键；也可由偶极的相互作用而产 生溶剂化作用。 介电常数（）15 H2O，ROH，HAc，H2SO4 HF-SbF3，FSO3H-SbF3 CF3COOH，（HPO3）n RNH2等,不含易取代H原子，主要靠偶极矩或范德华力相互作用产生溶剂化作用。,2.44D 15-20 -O-(Et)2O,THF, ;RX(CH3Cl, CH3Cl,);RO;,2.44D 15-20 惰性溶剂：氯苯，苯，苯，二甲苯；正己烷，正庚烷，环己烷，石油醚等,81,酸碱催化剂,Brnsted酸碱（质子）理论 酸：给出质子的物质 碱：接受质子的物质 Lewis酸碱（电子）理论 酸：接受电子对的物质 碱：给出电子对的物质 一种物质究竟属于酸还是属于碱，还是酸碱配合物取决于它参与的反应,没有盐的概念，只有 酸、碱和酸碱的络合物,82,常用的酸碱催化剂,Brnsted酸,Lewis酸,碱性催化剂,无机酸：如HCl HBr，HI，H2SO4 H3PO4等 强酸弱盐： NH4Cl， 有机酸：,AlCl3，ZnCL2 FeCl3 ，SnCl4 BF3，TiCl4 这类催化剂常用在 无水环境中,金属氢氧化物 金属氧化物 强碱弱酸盐类 有机碱 醇钠、氨基钠 金属有机化合物 NaOH等 Na2CO3等 NaHCO3等,83,相转移催化剂（PTC）,Phase transfer catalyst 使一种反应物由一相转移到另一相中的参加反应的物质，它促使一个可溶于有机溶剂的底物和一个不溶于此溶剂的离子型试剂两者之间发生反应 相转移催化反应 方法简单 后处理方便 试剂价格低廉,84,相转移催化剂（PTC）,鎓（内）盐（yelide or ylid） 在相邻原子上有相反电荷的中性分子。 通常为含O， S，As， N，P等 可以写成共振式，其中一个共振杂化体有双键 冠醚类 非环多醚类 胺类,中心原子,中心原子的取代基,负离子,85,相转移催化剂（PTC）,影响因素 搅拌速率 非均相体系，传质影响大 溶剂 固-液体系中，使用冠醚或叔胺时，一般使用助溶剂。,86,作业,Brnsted酸碱的概念；Lewis酸碱的概念 鎓（内）盐的概念,87,手性制药技术,概述 手性 对称 异构体 旋光性 化学法制备手性药物 生物酶法制备手性药物,88,手性化合物的标记,D，L标记 ，标记 R，S标记 xyzw，从Cw方向看，若xyz顺时针，则为R；否则为S,89,手性化合物的标记,D，L标记 ，标记 R，S标记,90,化学法制备手性药物,化学拆分,通常拆分碱性物质用 酸性拆分剂（酒石酸） 拆分酸性物质用碱性 拆分剂（-苯基乙胺）,产品较多时采用此法,91,作业,找出5种以上在本章中出现的化合物的手性中心,92,DL-苏型-1-对硝基苯基-2-氨基-1,3-丙二醇的拆分,诱导结晶拆分法,增加溶解度,饱和水溶液,晶种,产品,补充原料，过饱和L型,析出,10kg D,L-苏型,93,作业,非对映异构体拆分和诱导结晶法拆分的过程和原理是什么？ 常见的推（斥）电子基团有哪些？常见的拉（吸）电子基团有哪些？,94,抗生素,用于治疗细菌和各种 微生物感染等疾病的药物,后来产生了具有免疫、抗肿瘤等活性的抗生素。,95,激素,通过血液循环或组织液 起传递信息作用的化学物质,96,激素,维持代谢的平衡； 促进细胞的分裂与分化，确保各组织、器官的正常生长、发育及成熟，并影响衰老过程； 影响神经系统的发育及其活动； 促进生殖器官的发育与成熟，调节生殖过程； 与神经系统密切配合，使机体能更好地适应环境变化。,97,基因工程表达的蛋白药物,干扰素 胰岛素 生长激素 红细胞生成素 抗体,98,疫苗,99,生物技术制药：发酵,概述 制药微生物生长与生产的关系 制药微生物菌种的建立 制药微生物培养基制备 灭菌工艺 制药微生物发酵培养技术 发酵工艺过程的检测与控制,100,发酵,微生物,次级代谢,初级代谢,小分子前体 如氨基酸，单糖 核苷酸和多糖 蛋白质、脂肪和核酸,结构特殊，含有 不常见的基团 如氨基糖，苯醌 香豆素，环氧基等,营养物质,具生理 活性的,抵抗 逆境 分解 毒素 生殖,微生物的生长与代谢，生理生化过程,药物粗品,分离纯化,药物纯品,101,微生物的生长,菌体生长期 发酵前期,菌体自溶期 发酵后期,产物合成期 发酵中期,大量生成并积累 初级代谢产物， 由于菌体生理状 况变化，初级代 谢产物开始向次 级代谢产物转化,x0,x,xd,td,2x0,定积分,倍增时间,t,102,菌体生长与药物生产的关系,初级代谢产物 如乳酸、醋酸,次级代谢产物 如抗生素、生 物碱等,产物形成,微生物生长,微生物量,产物量,103,基质（营养）利用,Monod方程,S,生物量,比消耗速率,消耗速率,最大比生长速率max意义： 培养基的利用效率最大值 饱和常数Ks表示菌体对基质 的亲和力，越小越好。,104,发酵制药基本过程,105,制药生产菌的选育与保藏,自然分离,活性测定,育种,保藏,分离目的,选择环境,采集样品,分离,稀释法,滤膜法,受试病菌,活性系,化合物,琼脂扩散,色谱法 靶向筛选 高通量筛选等,自然育种,诱变育种,杂交育种,基因工程,菌种,单孢子悬液,琼脂平板分离,优良菌株,适当稀释,单菌落生产 能力测试,物理,化学,生物,接合,融合,斜面低温保藏,沙土管保藏,冷冻干燥保藏,液体石蜡 密封保藏,液氮保藏,菌种库,106,培养基,培养基,水,C源,