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文档简介
实验十 流感病毒的分离鉴定(二),1、血细胞凝集实验 2、血细胞凝集抑制试验,目的:熟悉病毒血凝、血凝抑制试验的方法及其应用。 原理:流感病毒颗粒表面有血凝素,具有使鸡、豚鼠等血细胞凝集的能力。把一定浓度的鸡红细胞加到待检的鸡胚尿囊液或羊水中,如出现血细胞凝集现象,即表示有病毒存在;如血凝阳性,则可进一步用血凝抑制试验进行病毒鉴定,流感病毒的血凝性,可被免疫血清中的特异性抗体所抑制,使其失去凝集作用,借此可用已知抗体鉴定未知病毒及病毒的型、亚型。,实验材料 (1)接种流感病毒的鸡胚。 (2)质量分数为05的鸡红细胞悬液。 (3)流感病毒型与亚型免疫血清。 (4)碘酒,酒精消毒棉球。 (5)灭菌的镊子、剪刀。 (6)无菌小试管,毛细滴管,吸管。 (7)生理盐水。 (8)试管、试管架。,实验方法: 1、血细胞凝集实验 (1)收获尿囊液:鸡胚孵育3d后,放4度冰箱过夜,次日取出鸡胚,消毒气室端卵壳,用小镊子在无大血管处撕破卵膜,以无菌毛细管吸取尿囊液,放入无菌试管中。 (2)取尿囊液01mL,作1:10稀释。,(3)取10支小试管,按给各管加入生理盐水0.2mL。 (4)取1:10稀释的尿囊液02mL,加人第1个试管中,混匀后,再吸出02mL加入第2个试管中;混匀后,从第2个试管吸出02mL加入第3个试管依次作倍比稀释至第九管,混匀后自第9个试管中取出02mL弃掉。这样各管液体量均为02mL,从第1-9个试管的尿囊液稀释度为1:20,1:40,1:5120,第10个试管为生理盐水对照管。 (5)稀释完毕后加人体积分数为05的压积鸡红细胞悬液,每管02mL,室温放置3060mn。,流感病毒血凝试验, ,(6)结果观察 观察时要轻拿、勿摇,首先观察对照管应无凝集,然 后再观察试验管,各管出现的凝集程度以“+”、“+”、“+”、“+”、“”表示,判断标准如下: “+”:全部红细胞凝集,凝集的红细胞铺满管底,边缘不整齐。,“+”:大部分红细胞凝集,在管底铺成薄膜状,但尚有少数红细胞不 凝,在管底中心形成小红点。 “+”:约有半数红细胞凝集,在管底铺成薄膜,面积较小,不 凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点。 “+”:只有少数红细胞凝集,不凝集的红细胞在管底中心聚成小 圆点,凝集的红细胞在小圆点的周围。 “”:不凝集,红细胞沉于管底,呈一边缘整齐的致密圆点。,凝集效价:能使红细胞呈“+”凝集的病毒最高稀释度为凝集效价,表示含有一个单位血凝抗原。 如表,第6个试管为“+”,且病毒稀释度最高,则该病毒悬液效价为1:640,即该病毒悬液稀释到1:640时,每02mL中含有一个血凝单位,配制4个血凝单位的病毒悬液时,病毒液应稀释成(1:640)X4,即1:160。,2、血细胞凝集抑制试验,按表加入材料和试剂,结果观察 先观察3支对照管,如抗原对照管出现完全凝集,血清对照和红细胞对照不发生凝集,再观察试验管。 血凝抑制效价:完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度,即该血清的抑制效价。 鉴定病毒时,效价应与原免疫血
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