生化实验技术与方法.ppt

糖的薄层层析,实验原理 薄层层析是一种微量而快速的层析方法。该法是把吸附剂或支持剂涂布在玻璃板上成为一薄层，将要分析的样品滴加到薄层上，然后用合适的溶剂进行展开，使样品各个成分分离，然后进行定性鉴定和定量测定。 根据原理的不同薄层层析通常有4种类型：吸附薄层层析，分配薄层层析，离子交换薄层层析和薄层电泳。,实验操作 硅胶薄板的制备：注意胶要均匀。 1.2 g硅胶H加4.0 ml0.5%CMC溶液，研磨数分钟后，倒在预先准备好的玻璃板上，铺开，使浆液分部均匀，放在水平台上，自然晾干。,2. 板的处理： 薄板的活化：105，0.5h 薄板的刮分：径向层析的优点是：样品展层后图谱呈弧形带状，使Rf值相近的化合物也能清楚地分开。 3. 点样：样品为鼠李糖、木糖和葡萄糖。点样量8-10l。注意：点样点的直径小于5mm，点样要少量多次，吹风机风力不能过大。 4. 展层：展层溶剂为：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=12：3：3：2（体积比），新鲜配制。 5. 显色：显色剂：苯胺-二苯胺-磷酸试剂。,20mm,10mm,30mm,8mm,苯丙氨酸解氨酶的提取纯化,实验原理 苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine：ammonia lyase，简称PAL；EC4.3.1.5）是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶，与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切有关，在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用。 本次实验是以银杏叶为原料采用分步盐析、透析脱盐、离子交换等方法得到苯丙氨酸解氨酶。,仪器 高速冷冻离心机；恒温水浴；电子天平；柱层析系统 试剂 酶提取液：0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液（含1mmol/LEDTA、20mmol/L-巯基乙醇） 固体硫酸铵 0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0，含0.5mmol/LEDTA，2.5%甘油，20mmol/L-巯基乙醇）； DEAE纤维素52,操作步骤 酶液提取 （1）植物材料2g，剪成小段，加入5倍体积的酶提取液，于冰浴上用研钵研磨。 （2）将已匀浆的酶液转入离心管，4000r冷冻离心30min。 （3）取离心后的上清液（酶粗提液），量出其体积，留样 0.5ml 。 硫酸铵分级沉淀酶蛋白 （1）根据实际体积、温度和硫酸铵饱和度用量表，算出达到38%饱和度应加入酶粗提液中的硫酸铵量，并称硫酸铵。（240g/L) （2）将酶液倒入烧杯内，边缓慢搅拌边缓慢加入称好的固体硫酸铵，待全部加完后，再缓慢搅拌10min；然后于9000r离心15min，保留上清液于烧杯内。 （3）根据硫酸铵饱和度用量表，算出从38%到75%饱和度所需硫酸铵用量。 （222g/L) （4）按上述（2）步同法处理，离心后，弃去上清液，保留沉淀。 （5）将沉淀溶于2ml酶抽提液中,留样 0.5ml 。 透析脱盐 酶液装入透析袋，放入低盐溶液中透析过夜,留样 0.5ml 。,银杏叶2g +10ml酶提取液研磨 4000rpm、30min 取上清液 加硫酸铵至饱和度38% 9000rpm、15min 取上清液 加硫酸铵至饱和度75% 9000rpm、15min 取沉淀 溶于2ml酶抽提液 透析,纯化 离子交换层析-DEAE纤维素 （1）称取DEAE纤维素52干粉11.5g，加20ml的0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0）浸泡4h以上（或浸泡过夜）。 （2）装柱：把预处理的DEAE纤维素52装柱。装柱完成后，用23个床体积的0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH8.0）洗脱平衡该柱。 （3）上样：把所得的酶洗脱液小心地注入柱床面中央，上样结束后，在床面以上小心地加入0.02mol/L磷酸盐缓冲液23cm厚液层。注意上样开始就收集流出液。 （4）洗柱：约用2倍床体积的A液（0.02mol/L磷酸盐缓冲液）及B液（含1mol/LNaCl 的0.02mol/L磷酸盐缓冲液）洗柱， 按洗脱管编号，取A280值高的管中洗脱液测其PAL的活力；合并主要含有PAL活力的各管洗脱液，并量出其体积（ml）。,苯丙氨酸解氨酶的活力测定,PAL催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸，反式肉桂酸在290nm处有最大吸收值。若酶的加入量适当，A290升高的速率可在几小时内保持不变，因此通过测定A290升高的速率以测定PAL活力。规定1h内A290增加0.01为PAL的一个活力单位。,取试管2支，按表中所述（0号为调零管，1号为测定管。注意按表格从上到下的顺序加入试剂）。（单位：ml）,将各管混匀，放入40恒温水浴保温1h（准确计时），到时各加0.2 ml 2 mol/LHCl终止反应。 紫外分光光度于波长290nm处测定1号管的A290。,蛋白质测定（考马斯亮蓝染色法） 取酶液0.1ml，用蒸馏水稀释至5ml 取试管8支，按下表加入各溶液： 将上述各试管混匀，静置2min，测定各管的A595。,PAL总活力、比活力、蛋白质含量的计算,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDSPAGE）测定蛋白质分子量,原理： SDS PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。 电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小（分子量）有关，如电荷、形状都一样，则电泳迁移率只与分子量有关。,SDS-PAGE是在PAG系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）。 SDS的作用：1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能使二硫键断裂，使蛋白质完全变性。 2.能与变性的蛋白质按比例结合，形成SDS-蛋白质复合物。 SDS-蛋白质复合物的特点：1. 由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。 2.复合物都是椭圆棒状，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的形状差异。 因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。,测定各条带的相对迁移率，根据已知蛋白质分子量和它们的相对迁移率，以相对迁移率为横坐标，lgMr为纵坐标作标准曲线。根据未知蛋白质的相对迁移率从标准曲线上查出它们的lgMr，再换算成蛋白质分子量,在一定范围内，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,操作如同PAGE。 样品：蛋白质要完全变性。 蛋白质+SDS+巯基乙醇 100 2-5分钟 标准蛋白市场有售，被测蛋白质的分子量应在标准蛋白分子量以内。 染色：考马氏亮蓝、银染色 该法测定蛋白质分子量的局限性： 1.蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，测定时只是它们的亚基或单条肽链的MW。 2. 电荷异常的蛋白质（如组蛋白，带大量正电荷） 3.结构异常，不于分子量呈线性关系（如胶原蛋白） 4.带有较大辅基的蛋白质（如糖蛋白）,实验操作,胶的制备,样品的处理：按0.5mg蛋白质/1mL溶液的比例向标准蛋白质或待测样品中加入样品溶解液（小试管），充分溶解后，置沸水浴3min，取出冷至室温。 加样量：20l，标准蛋白（M）全加。 电泳：点样端负极，恒压：开始80V，待样品进入分离胶后120V。 电极缓冲液：pH