实验二酶活力测定方法的研究预习报告

酶活力测定方法的研究一 探究背景： 酶是催化生物体内生化反应的重要成分，它可以在常温常压下非常高效的催化化学反应。对于酶，我们最关注的的就是它的活性。在实验中，当我们做酶实验时，只有知道自己在做的酶是有活性的，我们后续的工作才有可能继续。在实验室购买特定的酶时，我们关注的不是购买的重量，而是购买到的酶活性有多少，能催化多少摩尔的化学反应。掌握酶催化的活性也有利于我们估计反应需要进行的时间。甚至在我们改造酶结构的时候，也许要一个标准证明我们的改造是有效的。这一切，都需要我们能够测定酶的活性。二 研究目标： 掌握酶的分离纯化方法；设计实验，测定酶的活性；体会在不同的酶中，具体的实验设计步骤是否相同；学会根据不同酶的特点，设计其酶活力的测定方法；探究酶活力测定的基本原则。三 研究策略： 首先在材料中纯化出我们想要测定活性的酶，找到一种方便、灵敏的检测该酶活性的方法。实验中，我认为最困难的一点是：纯化，生物体中的酶含量少，种类多。且为蛋白质构成，因此较为脆弱，纯化手段必须温和。这个过程中，我们要注意结合酶本身的性质，进行纯化和活力测定。活力测定的总思路是：在底物过量的情况下，在最适pH、温度等条件下，测定某种酶作用产物的生成速度以表征酶的催化能力。2四 研究方案及可行性分析： 时间有限，我们就设计淀粉酶和转氨酶活性的测定。分析并比较它们设计思路，设计细节的异同点。 在纯化淀粉酶的过程中，我们使用加有碘的淀粉溶液冲柱，将植物组织初提液注入柱层析中，观察柱中明显变淡的部分，即为我们想要的淀粉酶。将底物放入试管中，测定单位时间，单位含量的酶催化底物的物质的量，以此作为酶活力的评判标准。在测定淀粉酶的活性时，加入1摩尔物质的量的淀粉，测定淀粉消失需要的时间，除以测得的酶总含量。值 得注意的是，淀粉酶分-淀粉酶和-淀粉酶，-淀粉酶pH3.6以下钝化，-淀粉酶高温钝化，据此我们可将其分开测量活性。五 具体实验设计：（1）淀粉酶：5.1.1所需物品：1.材料：小麦种子（芽约长1cm）、交联葡聚糖凝胶G-25 2.试剂：碘水、pH5.6柠檬酸缓冲液、3,5-二硝基水杨酸溶液、麦芽糖标准液、1%淀粉溶液、生理盐水 3.仪器：722-分光光度计、离心机、紫外分光光度计、柱层析、部分收集器、半透膜5.1.2具体 操作步骤：5.1.2.1分离纯化： 将漂洗好的凝胶除气后，边搅拌边倒入柱中，同时开始洗脱。先倒入用1.5g小麦种子研磨成匀浆状的滤液，待液体快要消失时，加入带有碘的1%淀粉溶液洗柱。持续注入淀粉溶液，直至将颜色变浅的一层洗脱为止。1 将洗脱出来的液体收集后，装入半透膜中，放入生理盐水缸中（除去麦芽糖）。取0.05l加入3,5-二硝基水杨酸沸水中加热5min观察是否变红，证明麦芽糖已经除净。 将收集到的酶使用分光光度法测定蛋白质含量(使用实验一的方法)绘制标准曲线。首先应将待测液稀释至2倍、5倍、10倍寻找合适倍数（由于实验一已经做过一个基础，我们认为刚萌发的小麦幼苗的蛋白质含量比豆芽多，但也不会高的太离谱）。 待测酶液稀释到一定倍数后，平行测量三次OD280和OD260，根据待测酶液OD280 /OD280求得蛋白质含量。 5.1.2.2活性测定1：1、2号试管各取酶液1ml。于700.5下热15min（钝化-淀粉酶）。 向1.2号管中加入pH5.6柠檬酸缓冲液（适于-淀粉酶作用，保持其活性） 将1.2号管冷却至400.5加入40的淀粉溶液2ml，摇匀立即放回恒温水浴，保持5min 后(-淀粉酶水解淀粉)，加入0.4M NaOH(终止反应)，摇匀备用。 3.4号管中各取酶液1ml，加入pH5.6柠檬酸缓冲液。在40水浴5min后，加入40的淀粉溶液2ml，摇匀立即放回恒温水浴，保持5min 后，加入0.4M NaOH(终止反应)，摇匀备用。 测定以上1-4管中麦芽糖浓度。以上各液各取1ml，分别加入15ml具塞试管中，与1ml pH5.6柠檬酸缓冲液混匀，沸水中加热5min，冷却后稀释至15ml，测量其OD520. 绘制标准曲线。如下图配置溶液管号6789101112麦芽糖标准液（ml）00.10.30.50.70.91.0 向每管加水至1ml，与1mlpH5.6柠檬酸缓冲液混匀，沸水中加热5min，冷却后稀释至15ml，测量其OD520.以麦芽糖含量为横坐标，OD520为纵坐标，绘制标准曲线。5.1.3数据记录：管号123456789OD520管号101112OD520根据一下公式计算结果1：-淀粉酶活性mggmin=（A-A）样品稀释总体积/样品重(g)5（-+-）淀粉酶活性mggmin=（A-A）样品稀释总体积/样品重(g)5六 质疑：1. 测定-淀粉酶活性40时，-淀粉酶会不会复性，如果会，需要多长时间 。2. 出了加0.4M NaOH可以终止反应，加HCl是否也可以？3. -淀粉酶的淀粉酶活性就定等于淀粉酶总活性减去-淀粉酶活性吗？同时测得的淀粉酶总活性时，-和-淀粉酶之间就不会有什么协同竞争等相互作用吗？七 预习思考题：1.酶活力测定的总体设计思路：首先明确我们需要测定的酶的状态：最适状态（pH，温度，盐离子浓度，过量底物，最适酶浓度），反应开始时的最初速度。其次我们在测定时，要明确我们测定的酶是纯正的，即我们测得的就是一种酶的活性（纯化时的要求）。同时，纯化步骤中，找到灵敏的确定酶活力的检测手段，每一步纯化都要确定纯化出的酶是有活性的。通过测定催化生成物的含量，推算酶活性。这就需要我们排除材料内原本含有的，一切可能影响到生成物含量测定的物质。必要的时候，需要设置对照组。2.影响最大的是： 酶的纯化，和催化的生成物的检测。因为，生命材料的复杂性决定了想要纯化出一种蛋白质是非常困难的。想要将它纯化出来，而且又保证活性，是一件非常难的事情。同时如何找到酶的最适条件也是一件比较费工夫的事情。应该注意的是，不但要纯化出来，还要保证酶活。3. 淀粉酶最适温度40，最适pH5.6，强碱性条件下失活；其中-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下发生钝化，-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化；两种酶都可催化淀粉形成麦芽糖。因此，在设计实验方案时，倘若在两种酶共存的体系（如实验中要用到的萌发的小麦种子）中，需要控制合适的条件使其中一种酶钝化后，在测定另一种酶的活力；另外，应控制反应时间，及时使用0.4M NaOH溶液终止反应，以保证测得的是酶催化的最初反应速度。转氨酶最适温 度37，最适pH7.45，强碱性条件下失活；最主要的两类转氨酶为谷丙转氨酶和谷草转氨酶；其中谷氨酸-丙酮酸转氨酶(GPT)能催化-酮戊二酸与丙氨酸转氨生成谷氨酸和丙酮酸，而谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（GOT）能催化-酮戊二酸与天门冬氨酸转氨生成谷氨酸及草酰乙酸，草酰乙酸在柠檬酸溶液中经苯胺处理脱羧亦可生成丙酮酸。因此，在对上述两种酶共存体系进行酶活力测定时，只需改变底物种类即可分别测定两种酶的活性，