GB 13648-92 化学试剂 氨基酸测定通则.pdf
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13648-92
氨基酸测定通则
基酸测定通则
13648-1992
- 资源描述：
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GB13648-92化学试剂氨基酸测定通则.rar,13648-92,氨基酸测定通则,基酸测定通则,13648-1992
- 内容简介：
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中华 人民 共 和 国 国 家 标 准 化学试荆 氨基酸测， 定通则 G B 1 3 6 4 8 一 9 2 C h e m i c a l r e a g e n t Ge n e r a l r u l e s f o r t h e d e t e r mi n a t i o n o f a mi n o a c i d s 主题内容与适用范围 本标准规定了氨基酸含量、 熔点、 比旋光度、 层析试验和灼烧残渣测定的通用方法。 本标准适用于氨基酸及其衍生物的分析。 本标准不适用于药用氨基酸的分析。 引用标准 G B 6 0 1 化学试剂 滴定分析( 容量分析) 用标准溶液的制备 G B 6 0 3 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备 G B 6 0 8 化学试剂 氮测定通用方法 G B 6 1 3 化学试剂比 旋光度测定通用方法 G B 6 1 7 化学试剂熔点范围测定通用方法 G B 6 6 8 2 实验室用水规格 G B 9 0 0 8 液相色谱法术语柱液相色谱法和平面色谱法 G B 9 7 4 1 化学试剂 灼烧残渣测定通用方法 一般规定 3 . 3 本标准中所用的水， 在没有注明其他要求时， 应符合G B 6 6 8 2 中三级水的规格。 本标准中 所用试剂的 纯度应在分析纯以上。 本标准中凡层析测定时， 氨基酸的R ， 值均应以在完全相同条件下的标准样品或工作标准样品的 33.13.2 R f 值为判断标准， 且每次测定时都不得省去作为判断标准的标准样品或工作标准样品。 . 4 本标准中凡层析测定需做杂质限量检测时， 应使用符合 6 . 1 . 2 . 2 条规定的工作标准样品。 熔点测定 按G B 6 1 7 之规定测定。 氨基酸的熔点数值可参考附录B ( 参考件) 。 比旋光度的测定 按G B 6 ”之规定测定。 氨基酸的比旋光度数值可参考附录B ( 参考件) 。 D L型氨基酸的比旋光度应控制在。 士。 . 5 0 范围之内。 国家技术监督局1 9 9 2 一 0 9 一 0 1 批准1 9 9 3 一 0 7 一 0 1 实施 G B 1 3 6 4 8 一9 2 6 层析试验 层析试验用于检测氨基酸的纯度及定性鉴别。 所有氨基酸均应从下列方法中 选择一种方法进行测 定。 6 . 1 纸层析 6 . ， . 1 方法原理 纸层析法是以滤纸为惰性支持物的一种层析法。 分离原理属分配层析的范畴， 它利用不同 溶质在静 止的水相， 亦即纸上所吸附的水为固定相和沿纸流动的有机相( 即流动相) 两相溶剂间的不断分配而达 到分离的目 的。 氨基酸经层析后， 常用比移值( R , ) 来表示各组分在层析谱中的位置, R ， 值按式( 1 ) 计算: 二 “ . ， . ， . . . . . . . . 。 (1) 式中: R , 比移值; d , 溶质迁移距离， c m; d m 流动相迁移距离, c m, 在一定的条件下， 同一氨基酸的R : 值是一定的， 但由于影响R , 值的因素较多一 般都采用与标准 物质对比， 即根据试样与标准物质在层析谱中R ， 值来进行鉴别， 并可根据显色后杂质斑点的多少和色 量来确定试样纯度。 6 . 1 . 2 试剂及材料 6 . ， . 2 . 1 标准样品 纸层析和薄层层析用标准样品， 纯度不小于9 9 . 5 %。 6 . ， . 2 . 2 工作标准样品 须经标准样品 验证， 主体含量不应少于9 8 . 0 %, 6 . 1 - 2 . 3 层析用纸 层析用纸是指具有一定强度， 质地均匀平整的纯棉浆制成的滤纸。 纸的裁切方向 应使流动相能顺着 纹理方向移动。定性用的层析滤纸灰分须小于。 . 1 %0 一般可选用新华一号层析滤纸。 6 . 1 - 2 - 4 显色剂( 常用显色剂) 称取4 g 布三酮( 苯骄戊三酮) ， 溶于1 0 0 0 m L乙 醉( 无水) 中， 置于 徐色瓶内 保存。 苟 三酮除 对脯氨 酸和轻脯氨酸产生黄色外， 其他氮基酸均产生紫色。 氮基酸的特殊显色剂可参照附录C ( 参考件) 。 6 . 1 . 2 . 5 展开剂 展开剂可参照附录A( 参考件) 之规定使用前制备。 必要时可选用其他展开剂。 6 . 1 . 2 . 6 展开室 可选用大小适宜的标本缸。 6 . 1 . 3 操作步骤 取新华一 号层析滤纸， 长3 0 c m， 离底边2 c m处用铅笔划一直线， 在直线两端2 c m处开始点样， 点 与点之间距离为2 c m， 点样扩散的直径不超过0 . 5 c m。 每点下面须用铅笔注明试样的名称和点样的量。 同一张层析纸上可点数个试样， 纸的宽度取决于试样的数目， 并留有点标准样品或工作标准样品的位 置。 称 取。 . 0 0 5 g 氨 基 酸 试 样， 精 确 至。 ， 0 0 0 1 g , 溶 于。 ， 5 m L 水 或 盆 酸 溶 掖C c ( H C I ) 一 0 . 5 m o l / L 中 ， 稀释至5 m L 。 用微量进样器或微量吸管点样， 每次点样后须用冷风吹干， 点样量按检测要求不少于 5 p l ， 不多于1 0 p L ， 即相当于5 0 p g 和1 0 0 p g . 氨基酸纸层析一般上行即可， 可将已吹干的层析纸两边卷成圆筒状， 用二根塑料丝上下固定。在一 G B 1 3 6 4 8 一 9 2 高为3 6 c m的标本缸内平放一培养皿， 内盛高度为。 . 5 c m的展开剂， 将层析纸置于缸内以展开剂的饱 和燕气平衡2 至4 h 后， 试样端朝下放入培养皿中， 盖紧玻璃盖。 展开1 2 至1 6 h 后， 流动相前沿即可上 升2 7 至2 9 c m， 此时将层析纸取出晾干或 5 0 干操， 按 6 . 1 . 4 条之规定显色. 6 . 1 . 4 显色 将已除去溶剂的层析纸喷以显色剂， 冷风吹干后于5 0 - 6 0 保温 1 5 2 0 m i n 即可显出有色斑点。 6 . 1 . 5 结果的确定 6 . 1 - 5 . 1 以1 0 0 p g 点样量， 按规定展开并显色 后， 只 显出 一个斑点， 且与标 准样品或工作标准样品的 R ， 值一致即为层析试验合格。 6 - 1 - 5 . 2 以1 0 0 p g 点样量， 按规定展开并显色后， 除显一个主斑点外， 其他氨基酸的斑点小于或等于 按产品规格规定制备的杂质标准的斑点时， 即可确定含其他氨基酸小于或等于标准。 6 . 2 薄层层析 6 . 2 . 1 方法原理 薄层层析是一种将吸附剂均匀地铺在一块玻璃板上形成一薄层， 在此薄层上进行色层分离的一种 层析法， 按分离机理可以分为吸附、 分配、 离子交换、 凝胶过滤等法。本标准主要使用吸附 薄层层析法。 6 . 2 . 2 试剂及材料 6 . 2 . 2 . 1 标准样品 应符合6 . 1 , 2 . 1 条之规定。 6 . 2 . 2 . 2 工作标准样品 应符合6 . 1 . 2 . 2 条之规定。 6 . 2 - 2 . 3 硅胶G 本品系白色均匀细粉， 粒度平均在1 0 - 4 0 p m之间， 含有约1 3 %的半水硫酸钙。 本品应符合下列分 离要求: 各取。0 4 0 g 二甲 基黄、 苏丹g 、 靛酚蓝， 溶于1 0 0 m L 苯中。 取2 p L ， 点样于按6 . 2 . 3 . 1 条之规 定制备的硅胶G板上， 用苯展开1 0 c m， 色谱图 应显示三个清晰的分离斑点， 靛酚蓝斑点接近于起始点， 二甲 基黄在色谱图的中央， 苏丹， 介于二者之间。 6 . 2 . 2 . 4 纤维素粉( 微晶形) 本 品 为 白 色 均 匀 细 粉 ， 平 均 粒 度 小 于3 q p m 本 品 应 符 合 下 列 分 离 要 求: 各 取0 . 0 2 5 g 亮 黑 、 鸡 冠 红、 快黄、 金莲橙. 溶于1 0 0 m L甲 醇和水的混合溶液( 1 +1 ) 中。 取1 0 p L ， 点样于按6 . 2 . 3 . 1 条之规定制 备的纤维素板上， 以丙醇+乙酸乙醋十水的混合溶液( 1 0 十1 +4 ) 为展开剂， 上行1 0 c m， 色谱图应显示 四个清晰的分离斑点， 即黑色斑点、 红色斑点， 两个黄色斑点， R ， 值依次增加。 6 . 2 - 2 . 5 展开剂 应符合6 . 1 . 2 . 5 条之规定。 必要时可选用其他展开剂。 6 . 2 - 2 . 6 显色剂 参照 6 . 1 . 2 . 4 条之规定。 6 . 2 3 操作步骤 6 . 2 - 3 . 1 制板 制备薄层板所用的 玻璃板必须表面光滑、 清洁， 其大小可根据需要选择， 小的可用载玻片， 大的可裁 成2 0 c m X 2 0 c m的玻璃片。 取一定量的吸附剂( 硅胶G可按2 5 3 0 g 加6 0 - 6 5 m L水; 纤维素粉可按8 g 加4 8 m L 水、 2 m L 乙醇) 在研钵中加水调成糊状， 按玻璃板的尺寸取一定量的吸附剂糊均匀地铺成一厚度为0 - 2 - 0 . 3 m c q 的薄层。 若使用涂铺器可按制造厂商推荐的方法涂铺。 铺成的薄层须置于水平台上室温干燥过 夜。 2 V , - 样品消耗高氯酸标准滴定溶液的体积, m L ; V , 空白 试验消耗高氯酸标准滴定溶液的体积， m L , c - 高氯酸标准滴定溶液的浓度， m o l / L s M与1 . 0 0 m L高氯酸标准滴定溶液 c ( H C I O , ) 质量 ; =1 . 0 0 0 m o l / L ) 相当的， 以 克表示的氨基酸的 m 试样的质量， R 。 8 灼烧残注 按G B 9 7 4 1 之规定测定。 G B 1 3 6 4 8 一9 2 附录A 常用氮基酸展开剂的组成和配比表 ( 参考件) 展开剂 配比 体积比) 说明 1 . 正了 醉+乙酸+乙醉( 无水) +水4 +1 +1 +2 纸层析常用展开剂 2 . 仲丁醉十甲酸( 8 4 %) +水1 5 斗3 +2 3 . 正丁醉十甲基乙基丁酮+氨水+水5 +3 +3 + 1 纸层析分离苏氨酸和别苏氨酸的展开剂 4仲丁醉+氨水( 3 %)1 5 十 6 纸层析常用展开剂 5 . 正丁醉十丙酮+二环己 胺+水1 0 十1 0 +2 +5 纸层析分离碱性氨基酸常用展开剂 6 . 正丁醉+丙酮+二乙胺+水 1 0 +1 0 +2 +5 薄层层析常用展开剂 7 . 异丙醉+甲 酸( 8 4 %) +水4 0 十2 +1 0 8 . 苯+毗咤+乙酸 8 十2 0 +2 9 . A+B 3+ 7 薄层层析分离氨基酸衍生物常用展开剂 A; 毗吮+乙酸十水 1 十1 十1 . 5 B乙酸乙醋+异丙醉1 0 +4 1 0 . 正丁醉+乙酸十水4 十 1 + 1 附录B 常用氮荃酸的比旋光度和熔点 ( 参考件) 表 B 1 中文名称英文名称( 缩写) 知 对 分 子 质 纠 熔点， 溶解度幻 比旋光度， ， 司黔2 5 D L - 丙氨酸DL - a l a n i n e ( Al a )8 9 . 0 92 9 5 d 1 6 . 6 L - 丙氨酸L - a l a n i n e ( A l a ) 8 9 . 0 92 9 7 d 1 6 . 6 5 A +1 4 . 6 D L - 精氨酸 D L - a r g i n i n e ( A r g )1 7 4 . 2 02 3 8 d L - 精氨酸 L - a r g i n i n e ( A r g )1 7 4 . 2 02 4 4 4 1 5 . 。 川) A 1 4 - 2 7 . 6 D L - 天冬队胺 D L - a s p a r a g in e ( A s p - N H ) ( As n ) 1 3 2 . 1 22 1 3 -2 1 5 d2 - 1 5 1 . 一 天冬 酞胺 L - a s p a r a g i n e ( A s p 一N H ) ( As n ) 1 3 2 - 1 2 2 3 6 d ( 水合物) 2 . 9 8 9 L C J + 2 8 . 6 L天冬氨酸 L - a s p a r t i c a c id ( A s p )1 3 3 . 3 02 6 9 2 7 10 . 5 A +2 5 . 4 L 一 瓜氨酸I . - c i t r u l l i n e Wi t ) 1 7 5 . 1 92 3 4 - 2 3 7 d 易溶 A +2 4 . 2 L 一 半肮氨酸 L - c y s t i n e ( C y s )1 2 1 . 1 5 易溶 A +6 . 5 D L - 脱氨酸D L - c y s t i n e ( C y s s ) 2 4 0 . 2 92 6 0 0 . 0 0 4 9 L 一 胧氮酸 L - c y s t i n e ( C y s s )2 4 0 . 2 9 2 5 8 - 2 6 1 d 0 . 0 1 1 C a 一2 3 2 2 6 2 G B 1 3 6 4 8 一 9 2 续表 s 1 中文名称英文名称( 缩写) 卜 对 分 子 质 划 熔点， ”溶解度幻比 旋光度9 1 M D 一 2 5 D I , 一 谷氨酸D L - g l u t a m i c a c i d ( G l u )1 4 7 . 1 3 2 2 5 - 2 2 7 d2 . 0 5 4 L 一 谷氨酸 L - g l u t a m i c a c i d ( G l u )1 4 7 . 1 3 2 4 7 - 2 4 9 d0 . 8 6 4 A +3 1 . 8 1. 各氨阶胺 L - g l u t a m i n e ( G I u 一N H ) ( Gl n ) 1 4 6 . 1 51 8 4 - 1 8 54 . 2 5 A 口 +3 1 . 8 月 一 氨酸 G l y c i n e ( G l y )7 5 . 0 72 9 2 42 4 . 9 9 D l . 组氨酸 DL - h i s t i d i n e ( Hi s ) 1 5 5 . 7 52 8 5 -2 8 6 4 易溶 L 一 组氨酸 1 : h i s t i d i n e ( Hi s )1 6 5 . 1 62 7 7 d 4 . 1 6 仁 8 一3 8 . 5 1 . - 轻脯氮酸L - h y d r o x y p r o l i n e ( P r o -U H ) ( Hy p ) 1 3 1 . 1 32 7 0 d3 6 . 1 1 L A- 7 - 5 0 . 5 1 l 一7 6 D I . 一 异亮氨酸 DL - i s o l e u c i n e ( 1 1 e )1 3 1 . 1 72 9 2 d 2 . 2 2 9 L - 异亮氨酸 L i s o l e u c i n e ( I l e )1 3 1 . 1 72 8 5 - 2 8 6 d 4 . 1 2 A 1 - 3 0 . 5 D L - 亮氮酸 DL - l e u c i n e ( L e n ) 1 3 1 . 1 73 3 2 d0 . 9 9 1 L - 亮氨酸 L - l e u c i n e ( L e n ) 1 3 1 . 1 73 3 7 d2 . 1 9 L A +1 6 . 0 B 一1 1 . 0 D L 一 赖氮酸D L - l y s i n e ( L y s )1 4 5 . 7 0 卜赖氨酸L - l y s i n e ( L y s )1 4 0 . 1 92 2 4 d易溶 L A , - I 2 5 . 9 B +1 3 . 5 D I , 一 甲 硫氨酸 ( 蛋氨酸) D L - me t h i o n i n e ( Me t ) 1 4 0 . 2 12 8 13 . 3 8 1 一 甲硫氨酸L - me t h i o n i n e ( Me t )1 4 0 . 2 12 8 8 d 易溶 L A J T 2 3 . 2 . B 一1 0 . 0 D L - 苯丙氨酸D I , p h c n y l a l a n i n e ( P h e )1 6 5 . 1 93 1 8 - 3 2 0 d3 . 4 2 L 一 苯丙氨酸 L - p h c n y l a l a n i n e ( P h e ) 1 6 5 . 1 92 8 3 - 2 8 4 d2 . 9 6 n 一 3 4 . 5 D I 一 脯氮酸 D L - p r a l i n e ( P r o )1 1 5 . 1 32 1 3 易溶 L - 脯氨酸L - p r o l i n e ( P r o )1 1 5 . 1 32 2 0 - 2 2 2 d1 6 2 . 3 C R 一6 0 . 3 B 一 8 6 . 2 D I . 丝氨酸DL - s e r i n e ( S e r )1 0 5 . 0 92 4 6 d “ 5 0 . 2 I . - 丝氨酸1 - s e r me ( S e r )1 0 5 . 0 9 2 2 3 - 2 2 6 d 26 上 R +1 5 . 1 B 一 7 . 5 D I : 苏氨酸 D L - t h r e o n i n e ( Th r )1 1 9 . 1 2 2 3 5 分解点 2 0 . 1 L - 苏氨酸L - t h r e o n i n e ( Th r ) 2 1 9 . 1 2 2 5 3 分 解点易溶L A 一1 5 . 0 B 一2 8 . 5 D 卜色氨酸D l . - t r y p t o p h a n e ( T r p )2 0 4 . 2 2 2 8 3 - 2 8 50 . 2 5 “ 0 I , 一 色氨酸L t r y p t o p h a n t ( T r p )2 0 4 . 2 22 8 1 - 2 8 2 1 . 1 4 户 ; L A +2 . 8 B 一3 3 . 7 D L - 酩氨酸D L - t y r o s i n e ( T y r )1 8 1 . 1 93 1 6 0 . 0 3 5 1 L 一 酩氨酸 1 ; t y r o s i n e ( T y r )1 8 1 . 1 93 4 2 . 4 d 0 . 0 4 5 C A 一1 0 . 0 D I , 撷氦酸 D L - y a l i n e ( V a D1 1 7 . 1 52 9 3 d 7 . 0 4 2 3 G B 1 3 6 4 8 一 9 2 续表 B l 中文名称 英文名称( 缩写) L - v a l i n e ( Va l) 对分子质 1 1 7 . 1 5 熔点， U 3 1 5 d 溶解度2 ， 8 . 8 5 a o 比 旋光度， ， 司黔2 ， L A J i - 2 8 . 3 L B J +5 . 6 3 注 1 ) d 代表达到熔点后分解。 2 ) 在2 5 于1 0 0 g 水中 溶解的质量。 特殊的温度条件则注明在右上角。 3 ) C A J 加5 0 2 0 0 m g 试样于1 0 m L 1 5 %盐酸中; C B 加5 0 - 2 0 0 m g 试样于1 0 m L水中; C 加9 5 1 . 9 m g 试样于 1 0 % 盐酸中。 附录C 盆基胜的特殊显色剂 ( 参考件) 甘氮酸显色剂 1 试剂 试 剂甲 : 称 取 0 . 2 0 g 邻 苯 二甲 醛， 溶 于 1 0 0 m L 丙 酮 中 。 试剂乙: 称取1 . 0 g 氢氧化钾， 溶于1 0 0 m L 9 5 %乙醇中。 2 显色 把层析纸在试剂甲中浸拉后， 于1 0 0 干燥， 再于试剂乙中浸拉， 于1 0 0 干燥1 0 m i n 。 甘氨酸显绿 目.1闷.es CC C 1 色。 C 2 酩盆截显色荆 C 2 . 1 试剂 试剂甲: 称取。 . 1 0 g l 一 亚硝基- 2 - 蔡酚， 溶于1 0 0 m L乙醇溶液( 7 5 %) 中。 试剂乙: 量取1 5 m L硝酸， 稀释至1 0 0 m L , C 2 . 2 显色 层析纸上先喷试剂甲， 吹干后， 再喷试剂乙， 1 0 0 保温3 m i n , 酪氨酸或含酪氨酸的多肤显红色， 其 底色为浅绿色， 放置3 0 m i n 后斑点转为枯红色， 其后渐褪去。 C 3 组扭酸和酷氮酸的显色荆 C 3 . 1 试剂 试剂甲: 称取4 . 5 0 g 对氨基苯磺酸， 加4 5 m L 盐酸， 加热溶解， 稀释至5 0 0 m L 。 在。 将此溶液与等 体积的亚硝酸钠溶液( 5 0 g / L ) 混合。 试剂乙: 碳酸钠溶液( 1 0 0 g / L ) , C 3 . 2 显色 层析纸上先喷试剂甲， 片刻后再喷试剂乙。 组氨酸显枯红色， 酪氨酸显红色。 C 4 丝盆登和径脯氮酸的显色荆 C q
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