B族维生素与辅酶维生素在代谢中的作用.docx

上次课复习：1.简要重复上次课内容的重点.2.B族维生素与辅酶；维生素在代谢中的作用本次课题（或教材章节题目）：第六章核酸 第一节 核酸通论第二节 核酸的结构教学要求：了解核酸的发现及研究简史；掌握核酸的种类和分布以及生物学功能；掌握DNA的一级结构和RNA的一结构； 重 点： 核酸的种类、化学组成和分布； DNA和RNA的一级结构特点；核酸衍生物及其功能难 点： DNA是遗传物质的证据教学手段及教具：课堂讲授与PowerPoint演示相结合。讲授内容及时间分配：复习、导入新课：5分第一节 核酸通论（30分）一、核酸的发现和研究简史 二、核酸的种类和分布 三、核酸的生物功能第二节 核酸的结构（50分）一、核苷酸二、核酸的共价结构(一)DNA的一级结构(二)RNA的一级结构小结：5分课后作业第477页： 1-10参考资料生物化学科学出版社现代生物学精要速览中文版王镜岩等译生物化学简明教程高等教育出版社罗纪盛等分子生物学第二版高等教育出版社朱玉贤李毅等第 15 次课 2 学时上次课复习：1.简要重复上次课内容的重点.2.核酸的种类、化学组成和分布；DNA的一级结构和RNA的一级结构特点3.引入新内容本次课题（或教材章节题目）：第六章核酸 第二节 核酸的结构教学要求：掌握DNA二级结构特点及维持结构稳定的因素；了解DNA二级结构的多肽性；了解三条链局部螺旋；了解超螺旋结构；掌握 DNA拓扑异构酶及特点；掌握tRNA的二级结构特点。重 点： DNA二级结构特点及维持结构稳定的因素； tRNA的二级结构特点。 难 点： 超螺旋结构；拓扑异构酶教学手段及教具：课堂讲授与PowerPoint演示相结合。讲授内容及时间分配：复习、导入新课：5分第六章核酸第二节 核酸的结构三、核酸的高级结构（40分）(一)DNA的二级结构1.DNA右手双螺旋结构特点2.二级结构因环境条件而改变3.三条链局部螺旋(二) DNA的三级结构（30分）1.超螺旋结构2.DNA拓扑学异构体 3.DNA拓扑异构酶4.有的病毒为单链DNA(三) RNA的高级结构（10分）小结：5分课后作业第500页：1,3，4,13,14参考资料生物化学科学出版社现代生物学精要速览中文版王镜岩等译生物化学简明教程高等教育出版社罗纪盛等分子生物学第二版高等教育出版社朱玉贤李毅等第 16 次课 2 学时上次课复习：1.简要重复上次课内容的重点.2. DNA二级结构特点及维持结构稳定的因素； tRNA的二级结构特点。 3.引入新内容本次课题（或教材章节题目）：第六章核酸 第三节 核酸的物化性质第四节 核酸的研究方法教学要求：掌握核酸的碱水解；了解核酸的酸碱性质；掌握核酸的紫外吸收和变性、杂交；掌握核酸的分离、提纯和定量测定的方法原理；了解DNA聚合酶链反应(PCR)；掌握核酸序列测定的原理及方法。重 点：核酸的紫外吸收和变性、杂交； tRNA的二级结构特点。核酸的分离、提纯和定量测定的方法原理； 难 点： PCR；核酸序列测定超螺旋结构； 教学手段及教具：课堂讲授与PowerPoint演示相结合。讲授内容及时间分配：复习、导入新课：5分第六章核酸第三节 核酸的物化性质（40分）一、核酸的水解二、核酸的酸碱性质三、核酸的紫外吸收四、核酸的变性、复性与杂交第四节 核酸的研究方法（40分）一、核酸的分离、提纯和定量测定二、核酸的超速离心三、核酸的凝胶电泳四、DNA聚合酶链反应(PCR) 五、印迹技术六、核酸的核苷酸序列测定小结：5分课后作业第522页1,4，5,6参考资料生物化学科学出版社现代生物学精要速览中文版王镜岩等译生物化学简明教程高等教育出版社罗纪盛等分子生物学第二版高等教育出版社朱玉贤李毅等第 17 次课 2 学时第六章 核酸第一节 核酸通论第二节 核酸的结构第三节 核酸物化性质第四节 核酸的研究方法第一节 核酸通论一、核酸的发现二、核酸的种类和分布三、核酸的生物功能一、核酸的发现与研究1. 核酸的发现 年瑞士化学家米歇尔（Miesher ，F.18441895）从脓细胞细胞核中核质。 年又从鲑鱼的精子细胞核中，随后在多种组织细胞中也发现了这类物质的存在-核酸。 多年后，从动物组织和酵母细胞分离出含蛋白质的核酸。 1889年Altmann制备了不含蛋白质的-核酸 本世纪年代，德国生理学家柯塞尔（Kossel，A.1853-1927 ）和他的学生琼斯（Johnew，W.1865-1935 ）、列文（Levene，P.A.1896-1940 ）的研究结果，才搞清楚核酸的化学成分及其最简单的基本结构。 年又确定了核酸有两种，一种是脱氧核糖核酸（），另一种是核糖核酸（）。2.核酸的早期研究 核素的功能 染色质与核酸 核酸中的碱基 四核苷酸假说 DNA与RNA 核酸的高度特异性二、核酸的种类和分布核酸分为两大类 脱氧核糖核酸 Deoxyribonucleic Acid （DNA） 核糖核酸 Ribonucleic Acid（RNA）（1）脱氧核糖核酸(DNA)：主要分布在细胞核或拟核中 原核生物细胞 真核生物细胞 病毒质粒(绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(cccDNA) 质粒：是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。 常被用做基因的载体。练习题 维生素D在体内的最高活性形式是_，它是由维生素D3分别在_和_二次_而来的。 B族维生素都可以作为辅酶的组分参与代谢。 脂溶性维生素都不能作为辅酶参与代谢。 下列辅酶中的哪个不是来自于维生素 A.CoA B.CoQ C.PLP D. FMN 肠道细菌可以合成下列哪种维生素？ A.维生素A B.维生素C C.维生素D D. 维生素K 将下列化学名称与B族维生素及其辅酶形式相匹配： (A)泛酸(B)烟酸(C)叶酸(D)硫胺素(E)核黄素(F)吡哆素(G)生物素FMNFADCoAPLPPMPTPPNADFH4 (2)核糖核酸(RNA):主要分布在细胞质中 tRNA：结构大小基本相同 rRNA：结构大小差异较大，rRNA含量最丰富。 mRNA：结构大小差异较大，mRNA种类最多。 真核生物细胞器中有自身的tRNA、rRNA和mRNA。 snRNA、 snoRNA、 SCRNA、反义RNA等三、核酸的生物功能 生命信息的储存与传递。表现在： DNA的复制与生物遗传信息的保持 RNA与生物遗传信息的表达 酶的催化功能核酸酶（核酶） 生物遗传变异的化学本质DNA结构变化分子生物学中的中心法则1.DNA是主要的遗传物质 细菌转化实验 研究这种转化因子的化学成分 T2噬菌体的感染实验（1）细菌转化实验n 1928年英国格里菲斯（Griffith，J.）的在研究肺炎球菌时发现肺炎双球菌有两种类型： 型（有毒） 型（无毒） 结论：有一种物质，能够从死细胞中进入活的细胞中，改变了活细胞的遗传性状，把它变成了有毒细菌。这种能转移的物质，叫做转化因子。（2）研究这种转化因子的化学成分 艾弗里（Avery ，O.T. 18771955 ）和他的合作者：用降解DNA、RNA和蛋白质的酶分别作用于有毒的S 型细胞抽提物，然后分别与无毒的R型细胞混合，观察转化现象发生。 结论：DNA是转化所必须的转化因子。 1944年得到研究的结果：只有DNA被酶解而遭到破坏的抽提物无转化作用。证明了转化因子就是核酸（），是将型肺炎双球细菌转化为型双球细菌的信息载体。（3）T2噬菌体的感染实验 1952年赫希尔（Heishey ，A.D.）和蔡斯（Chase ，M.），用同位素标记法进行实验。2.RNA参与蛋白质的生物合成 tRNA: 1958年分离出，占细胞总RNA的15%，是转换器，携带氨基酸并起解译作用。 rRNA:1959年分离出，占细胞总RNA的80%，核糖体的组分，核糖体是蛋白质合成的场所，23SRNA具有核酶活性，能催化肽键形成. mRNA: 1961年分离出，占细胞总RNA的35%，是信使，携带DNA的遗传信息并起蛋白质合成的模板作用。3.RNA功能的多样性 控制蛋白质的合成 作用于RNA转录后加工与修饰 基因表达与细胞功能的调节 生物催化与其他细胞持家功能 遗传信息的加工与进化其核心作用是：基因表达的信息加工和调节。477页，7,8，9,10第二节 核酸的结构一、核苷酸二、核酸的共价结构三、DNA的高级结构四、RNA的高级结构 核酸是一种多聚核苷酸。一、核苷酸（一）构成核酸的嘌呤碱与嘧啶碱：A、G、C、T、U。1.嘌呤碱2.嘧啶碱3.稀有碱基：大多出现在tRNA中 次黄嘌呤 ( I ) 二氢尿嘧啶 ( D ) 假尿嘧啶 ( ) 5-甲基胞嘧啶( m5C ) 1-甲基腺嘌呤( m1A ) N6- N6甲基腺嘌呤 ( m6A )几种稀有硷基 表 13-24.碱基的结构特征 在260nm左右紫外区有吸收 酮式烯醇式 胺式亚胺式(二）组成核酸的戊糖 组成核酸的戊糖有两种：（三）核苷 nucleoside（四）核苷酸nucleotide 核苷酸是核苷的磷酸酯.核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸核酸中的核苷酸书写DNA中 RNA中腺脱氧核苷酸（dAMP） 腺苷酸（AMP）鸟脱氧核苷酸（dGMP） 鸟苷酸（GMP）胞脱氧核苷酸（dCMP） 胞苷酸（CMP）胸腺脱氧核苷酸（dTMP） 尿苷酸（UMP）2.两类核酸的基本化学组成比较3.核苷酸衍生物 可以游离形式存在于细胞中。 用于合成核酸的原料或其它功能。 一般为5核苷酸的继续磷酸化和环化磷酸化。 常见的有：ATP、GTP、cAMP、 cGMP 含有核苷酸的辅酶： NAD、NADP、FMN、 FAD继续磷酸化 5-NMP、 5-NDP、 5-NTP环化磷酸化cAMP： 3，5-环腺苷酸 作为第二信使参与细胞信号传递。 二、核酸的共价结构（多聚核苷酸）（一）核酸中核苷酸的连接方式 通过 3，5 磷酸二酯键连接。v 碱基序列从左到右表示5 31.证明是3 ，5 磷酸二酯键连接的试验2.多聚核苷酸的表示方式（二）DNA的一级结构 多核苷酸链均有5- 末端和3- 末端。 DNA 的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。 大小表示单位用bp （碱基个数）： 如108 bp1.基因与基因组 基因（gene） ：一段有功能的DNA 片段，生物细胞中DNA 分子的最小功能单位（交换单位）。 基因组（genome） ：某生物体（完整单倍体）所含全部遗传物质的总和。 包括：核基因组（拟核/ 核DNA ）及核外（质粒/ 质体DNA ）结构基因与调节基因1.原核生物基因组的特点 通常只有一个“ 染色体DNA 分子” 大部分为结构基因，只出现一次或几次。 功能相关的基因常串在一起。 有基因重叠象。2.真核生物基因组的特点 基因一般分布在若干条染色体上。 有重复序列: 单拷贝序列；中度重复序列；高度重复序列 有断裂基因：内含子与外显子 (三)RNA的一级结构1. tRNA (转运RNA)v 第一个被测定序列的RNA是- 酵母丙氨酸tRNAv 通常有7393个核苷酸组成，含有较多的稀有碱基。有一些保守序列。v 5 端PG- CPCPAOH 3 端2.rRNA （核糖体RNA）v 细菌rRNA: 5S、16S、23S三种。(前体是30SrRNA)v 哺乳动物rRNA: 5S、 5.8S、 18S、28S四种。(后三者前体是45SrRNA)v 含修饰核苷：rRNA的甲基化较多，且发生在核糖上的多(Gm, Um)3.mRNA（信使RNA)原核生物：一条mRNA链上有多个编码区，为多顺反子。 无修饰碱基。真核生物：一条mRNA链上一个编码区，即为单顺反子。成熟mRNA两端均带有3 OH。5末端有帽子结构： 3末端有polyA结构： 485页5 帽子结构(3-mG-5 ppp5-Nm-3-P)：v 帽子结构的作用：l 抗5-核酸外切酶的降解作用l 有助于核糖体对mRNA的识别和结合。三、核酸的高级结构1. DNA碱基组成的Chargaff规则（20世纪40年代）A=T，C=G；ACGT； A G C T；不同种属的DNA碱基组成不同；同一个体不同器官、不同组织的DNA具有相同的碱基组成。2. DNA的双螺旋结构(线形或环形）（1） 双螺旋结构的研究背景 碱基组成的Chargaff规则 DNA纤维的X线图谱分析显示DNA是螺旋型分子，且为双链分子。 Franklin和Wilkins获得了高质量的DNA的X线衍射照片，显示出DNA是螺旋形分子，而且从密度上提示DNA是双链分子。（2）1953年Watson和Crick总结前人的研究成果 -提出了DNA的双螺旋结构模型。沃林、克里克同威尔金斯一道于1962年获得诺贝尔奖。 （3） DNA双螺旋结构模型的要点碱基互补（AT；CG）维持双螺旋结构稳定的因素 碱基之间的堆积力： 两条链碱基之间的氢键（离子键、范德华力） 环境中的正离子3.DNA结构的多样性 B-DNA： 相对湿度92% 每周10.4 个核苷酸对 A-DNA： 相对湿度75% 每周11 个核苷酸对，粗短 Z-DNA： 左手螺旋每周12 个核苷酸对，细长4.H-DNA- 三条链局部螺旋1957年，Rich A提出 三条链特点嘌呤嘧啶嘌呤 嘧啶嘌呤嘧啶 体内存在可能性小。(二) DNA的三级结构 490页 是在DNA二级结构（双螺旋）基础上进一步扭曲形成超螺旋，使体积压缩。(密度加大）1.DNA拓扑学异构体 DNA topological isomer 研究物体变形后仍然保留下来的结构特性。 DNA拓扑异构酶（ DNA topoisomerase） 型拓扑异构酶（topoisomerase） 型拓扑异构酶（topoisomerase）型拓扑异构酶（topoisomerase，拧紧） 负超螺旋与正超螺旋 使双链负超螺旋DNA松弛环状正超螺旋 切开环状单条链、打结与解结、环连与解环连.型拓扑异构酶（topoisomerase，拧松） 使双链松弛环状DNA负超螺旋；正超螺旋松弛环状 切开环状双条链、打结与解结、环连与解环连 DNA的负超螺旋和松弛状态对于DNA的复制和基因表达调控起重要作用。体内多以负超存在。型拓扑异构酶的作用2.DNA与蛋白质复合物的结构（核蛋白） 病毒 细菌的拟核 真核生物的染色体与染色质（1）病毒 病毒:是一类非细胞形态的介于生命与非生命形式之间的物质。 个体微小 仅具有DNA 或RNA ； 寄生生活；具有受体连结蛋白 类病毒: 是已知最小的致病RNA ，不含蛋白质。 噬菌体、植物病毒、动物病毒 正链RNA 病毒与负链RNA 病毒？ （2）原核生物的拟核 细菌质粒、真核线粒体、叶绿体、细菌染色体中的DNA（共价闭合环形DNA (cccDNA)）。原核生物的染色体DNA与碱性蛋白和少量RNA结合组成许多突环。（3）真核生物的染色体与染色质 核小体：在真核生物细胞核内，双链(螺旋)线形DNA三级结构与一组组蛋白共同组成核小体。 在核小体的基础上，DNA链经反复折叠形成染色体.核小体中的组蛋白 组蛋白带正电荷的碱性基团与DNA 中带负电荷的磷酸基团静电吸引。 酸处理：使磷酸基团质子化，失去所带的负电荷，复合物解离。 高盐溶液处理：阳离子取代组蛋白与DNA 结合，复合物解离。 四、RNA的高级结构496页v 天然RNA一般都是以单链形式存在。由单链自身回折而成双链区。v 一般双链区占全部RNA分子的50左右（一）tRNA的高级结构(转运RNA)1.tRNA的二级结构五部分： 氨基酸接受臂 二氢尿嘧啶环 反密码环 额外环：是分类的指标。 TCG 环2.tRNA的三级结构均为倒L型酵母Ala- tRNA的碱基顺序三维结构（二）rRNA的高级结构（三） mRNA(信使RNA)的高级结构 游离的mRNA可以产生高级结构 ，但在核糖体上翻译时必须解开。第三节 核酸的物化性质502页一、核酸的水解二、核酸的酸碱性质三、核酸的紫外吸收四、核酸的变性、复性与杂交一、核酸的水解参书502页(一)酸水解v 糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解。v 对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键。(二)碱水解v 碱水解核酸时先形成2,3 环核苷酸，再水解为2或3 核苷酸v DNA的磷酸酯键对碱稳定。常用来除去溶液中的RNA杂质。(脱氧核糖上无2-OH，不能形成碱水解的中间产物)。(三)酶水解 水解磷酸二酯键的酶： 非特异性-磷酸二酯酶 专一水解核酸的磷酸二酯键-核酸酶 核酸酶的分类 核糖核酸酶与脱氧核糖核酸酶；各自有各自的作用位点？ 核酸内切酶与核酸外切酶(方向性3至5或5至3)； 双链酶与单链酶 作用于3-OH(b位）或5-OH（a位)与磷酸基之间断裂的酶.限制性内切酶v 在细菌中发现有这类酶，主要是降解外源的DNA。v 识别双链DNA上特定的位点4-8碱基对(bp)范围)，将两条链都切断，形成粘末端和平末端。具有极高专一性。v 往往与一种甲基化酶同时成对存在，具有相同的底物专一性，具有识别相同碱基序列的能力。限制性内切酶生物学功能及应用价值v 降解外面侵入的DNA，但不降解自身细胞中的DNA，因为在自身DNA的酶切位点上经甲基化修饰而受到保护。是基因工程、体外重组、基因的分离、测序最重要的工具酶（手术刀）。v 不同的限制性内切酶酶切位点不同v 限制性内切酶对DNA片段做物理图谱分析v 需将DNA用限制性内切酶切成一组片段，以特异序列作标记，确定这些片段的位置，即得到DNA的物理图谱。回文序列palindrome5 G A A T T C 3 3 C T T A A G 5 EcoRI 切点的两条链中的序列从相反方向阅读是一样的，称为回文序列palindrome 。从正向和反向阅读是同一句子 应用于克隆,测序,检测DNA二、核酸的酸碱性质v 是两性离子。v DNA的等电点为44.5，RNA的等电点为22.5。原因：是RNA分子中核糖基 2-OH 通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。v 核苷酸的等电点在制备和分析核苷酸中应用。三、核酸的紫外吸收v 最大吸收峰在 260nm 附近。因碱基有共轭双键。v 与溶液的pH、核酸单链和双链有关。v 核苷酸单链双链DNA的纯度的判定v 一般用 OD260/OD280 的比值来判断。v 纯的DNA为1.8；（若小于1.8，说明有蛋白质残留）纯RNA为2.0；四、核酸的嵌入染料v 溴 化乙锭（ethidium bromide, EtBr）l 在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。在适当的下，荧光强度与DNA片段的大小(或数量)成正比。l 可插入碱基与碱基之间造成移码突变。五、核酸的变性、复性及杂交1.引起核酸变性的因素 温度升高、酸碱度改变、有机溶剂（甲醛、尿素）。增色效应与减色效应v 增色效应：双链DNA变性过程中其光吸收升高。 v 减色效应：在DNA复性(恢复双链)的过程中则伴随着光吸收的减少。v 3.DNA的熔点或溶解温度(Tm)v 将引起DNA双螺旋结构失去一半时或将紫外吸收的增加量达最大增量一半时的温度值称为该DNA的熔点或溶解温度用Tm 表示。v DNA热变性后，形成无规卷曲，粘度下降，沉降系数和浮力密度增加。影响DNA的Tm大小的因素v 碱基的构成与排列：图5.14DNA的GC对含量越高, Tm值也越高对于GC对百分比相同的DNA，则GC对相对集中的Tm值大v DNA 片段长度： 大片段DNA分子之间比较时，片段长短对Tm值的影响较小, 与组成和排列相关。小于100bp 的 DNA分子比较，片段愈短， 变性愈快，Tm值愈小。v 介质中的离子强度越低，其Tm范围越宽，Tm越低， ： 有变性剂存在，使Tm 下降。 4.影响核酸复性的因素v DNA复性的必要条件l 盐浓度必须高，破坏磷酸基团的负电荷斥力（0.15 M 0.5 M NaCl）l 温度和时间：缓慢冷却，一定时间。l DNA的浓度正相关；DNA片断的大小负相关l DNA分子的复杂度（重复序列多少？）负相关l 溶液的离子浓度正相关l 复性反应速度用Cot 1/2来衡量：表示复性一半的Cot值。（二） 核酸的杂交l 在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成双链，或DNA单链与RNA链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程称为。（ DNA-RNA双链与ADNA相似，粗短）l 杂交程度与同源性成正比。核酸杂交的分子基础l 核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院的Roy Britten及其同事发明的。l 所依据的原理是：碱基互补第四节 核酸的研究方法一、核酸的分离、提纯和定量测定二、核酸的超速离心三、核酸的凝胶电泳四、核酸化学中几种重要技术一、核酸的分离、提纯和定量测定(一)DNA和RNA的分离v DNA为白色纤维状固体，为线性分子，极不对称，溶液粘度高。对碱稳定。v RNA为白色粉末，溶液粘度低，对碱不稳定。(二)核酸含量的测定 紫外分光光度法、定磷法、定糖法v D核糖： 与浓盐酸和苔黑酚（甲基间苯二酚）共热产 生绿色。v D2脱氧核糖：与酸和二苯胺一同加热产生蓝紫色。二、核酸的超速离心(一)核酸密度的测定(二)测定DNA中的G-C含量 (三)溶液中核酸构象的研究(四)用于核酸的制备三、核酸的凝胶电泳基本原理： 一种分子（带有一定电荷）被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。 用途：v DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图、蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。琼脂糖及聚