中药羌活有效成分的提取工艺研究

聊城大学本科毕业论文（设计） 本科生毕业论文（设计）题 目：中药羌活有效成分的提取工艺研究专业代码：0703作者姓名：亢静静学 号：2009201799单 位：化学化工学院09级3班指导教师：柳仁民 教授 2013年5月25日 原创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，论文中不含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得聊城大学或其他教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的相应责任。学位论文作者签名：日期 指 导 教 师 签 名： 日期 聊城大学本科毕业论文（设计） 目录前 言11. 中药有效成分提取方法21.1 溶剂提取法21.1.1 溶剂提取法的原理21.1.2 溶剂的选择21.1.3 提取方法21.2 水蒸气蒸馏法31.3 超声波提取法31.4 微波提取法31.5 超临界流体萃取法31.6 破碎提取法31.7 酶法提取42. 高效液相色谱法简介42.1 高效液相色谱法的简介42.1.1 高效液相色谱的特点42.1.2 液相色谱的分离原理和分类52.2 高效液相色谱法的应用53. 羌活性状及药理作用研究53.1 羌活性状63.2 主要成分63.3 药理作用74. 实验部分84.1 实验仪器84.2 试剂与材料84.3 色谱条件94.4 提取过程94.4.1 不同提取方法的比较94.4.2 不同提取溶剂的比较94.4.3 不同浓度甲醇的比较94.4.4 不同提取次数的比较105. 结果与讨论105.1 HPLC分离条件的优化105.2 不同提取方法的比较125.3 不同提取溶剂提取效率的比较135.4 不同浓度甲醇提取效率的比较145.5 不同提取次数提取效率的比较15结论15参考文献17致谢19摘要为了将中药羌活中的有效成分提取出来，分别采用冷浸、超声与加热回流三种提取方法，使用水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯作提取溶剂，对中药羌活中活性成分进行提取，并通过对高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）分离条件进行优化，建立了分离分析羌活中活性成分的方法，用HPLC对提取液进行了分析，比较了不同提取方法，不同提取溶剂提取率的高低。实验结果表明：提取溶剂的种类、提取方法，提取次数均明显地影响提取效率。其中用纯甲醇为提取剂，采用加热回流的方法在80 条件下提取0.5 h时的提取效率最佳。 关键词：高效液相色谱；羌活；超声；回流；冷浸AbstractThe extraction methods of active components from Chinese traditional medicine. Rhizoma et Radix Notopterygii; incised notopterygium rhizome and root were tested including marinating, ultrasonic and reflux with methanol, ethanol and ethyl acetate as extraction solvent. HPLC separation conditions of nunciferine and pronuciferine were investigated. The extracted samples were analyzed by HPLC and the results indicated that the contents of each compound extracted by different extraction methods were diverse. Among these extraction methods, ultrasonic extraction for 0.5h under the 80 temperature using methanol as 100%methanol solvent was the best method. The results suggested that the extraction method, and time all remarkably affected the extraction efficiency.Key Words: HPLC; Radix Notopterygii; incised notopterygium rhizome and root; marinating; ultrasonic; reflux.中药羌活中有效成分的提取工艺研究前 言羌活药材为常用中药，来源于伞形科植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang或宽叶羌活Notopterygium franchetii H. De Boiss.的干燥根及茎1，药用历史悠久，始见于神农本草经，列于独活项下。主要分布于我国西部四川、甘肃、青海、云南、西藏等省(自治区)。其性温，味辛、苦，具有散寒、祛风、除湿、止痛之功效，现代研究表明羌活具有明显的镇痛、抗炎、改善血液循环及保护肝脏的作用2-9。现有研究表明，羌活化学成分复杂，主要含有挥发油、香豆素、有机酸、氨基酸、糖类等化学成分，其中香豆素类成分有乙基羌活醇、羌活酚缩醛、环氧脱水羌活酚、佛手内酯、紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素、珊瑚菜内酯等10-16。此外，药理研究结果显示香豆素类成分具有显著的药理作用，如异欧前胡素具有镇痛、抗炎、解热等作用17。近年来，由于HPLC引用了高压泵和高灵敏度的检测器，使其具有很多优越性，主要表现为分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、分析对象范围广。HPLC广泛用于天然产物、生命活性物质、生物大分子、高聚物、高分子化合物以及无机物的分离测定。因此，利用HPLC对羌活中主要化合物的提取方法进行研究具有非常重要的意义。本课题对中药羌活中有效成分用不同溶剂和不同提取方法进行研究，建立羌活中有效成分的高效液相色谱的分析方法。通过HPLC分析，结果表明：提取方法，提取溶剂，溶剂浓度，提取时间均影响提取效率，其中加热回流提取效率最高，采用甲醇作为提取溶剂提取效率最高且提取三次即可提取完全；故用纯甲醇提取3次，每次回流0.5 h。1. 中药有效成分提取方法我国的天然药物资源丰富，但中药成分一般较复杂，有效成分含量差别大，杂质占大部分，而且药物中往往多种有效成分共存，为寻找新的药物，弄清药物中各种有效成分的药理作用，必须将有效成分从中草药中提取出来，才能进一步的研究和利用，所以中草药中有效成分的提取是中药化学研究的首要前提。提取，是指用适当的方法或适当的溶剂将中草药中的化学成分从植物组织中抽提出来，由此提取出来的有效成分往往不止一种，为得到其中的某种有效成分，还需进一步的分离。中药有效成分的提取一般采用传统的溶剂提取法，而近些年来出现了一些新技术，如超声波提取法、微波提取法、超临界流体提取法。 1.1 溶剂提取法 1.1.1 溶剂提取法的原理溶剂提取法是根据中草药中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。当溶剂加到中草药原料（需适当粉碎）中时，溶剂由于扩散、渗透作用逐渐通过细胞壁透入到细胞内，溶解了可溶性物质，而造成细胞内外的浓度差，于是细胞内的浓溶液不断向外扩散，溶剂又不断进入药材组织细胞中，如此多次往返，直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡时，将此饱和溶液滤出，继续多次加入新溶剂，就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。1.1.2 溶剂的选择运用溶剂提取法的关键，是选择适当的溶剂。溶剂选择适当，就可以比较顺利地将需要的成分提取出来。选择溶剂要注意以下三点：（1) 溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小；(2) 溶剂不能与中药的成分起化学变化；(3) 溶剂要经济、易得、使用安全等。 1.1.3 提取方法用溶剂提取中草药成分，常用浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法及连续回流提取法等。 1.2 水蒸气蒸馏法此法适用于具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏，与水不发生反应，有难溶或不溶于水的化学成分的提取，如挥发油。分为共水蒸馏法、通水蒸气蒸馏法和水上蒸馏法三种。 1.3 超声波提取法超声波辅助萃取是超声能量辅助作用下的提取方法，主要是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取，提高中草药有效成分的产率18。另外超声波破碎过程是一个物理过程，浸提过程中无化学反应，被浸提的生物活性物质在短时间内保持不变，生物活性不减。 1.4 微波提取法微波提取（microwave assisted extraction）是指利用微波能将中药细胞内的有效成分提取出来的一种新技术，其原理是微波加热促使中药植物细胞内的极性物质吸收电磁能，产生的热量促使细胞内温度上升，压力增大，将细胞膜、细胞壁冲破，形成孔洞，细胞外的溶剂通过孔洞进入细胞内，有效成分则溶解在溶剂中19。微波提取可对中草药中的不同成分进行选择性加热，易于将目标成分提取，因而具有选择性。微波提取设备简单，使用范围广，可用于对中药中挥发油、苷类、生物碱、多糖、黄酮、有机酸等有效成分的提取，与传统提取法相比，它提取时间短、效率高、污染小、重现性好，但微波提取要求中药含有一定的水分，对含水少的细胞不易破壁，有效成分难提取。微波对某些化合物有一定的降解作用，微波对人体，尤其是眼睛有一定程度的影响，所以应用时，应选择合理的提取工艺条件，并注意微波的泄露和防护20。 1.5 超临界流体萃取法它是利用超临界状态下的流体为萃取剂，从液体或固体中萃取中药材中的药效成分并进行分离的方法。本方法提取效率高，生产周期短，易发现天然植物中新的活性成分，极少损失易挥发组分或破坏生理活性物质，无溶剂残留，产品质量高。1.6 破碎提取法 破碎提取法是使中草药在破碎提取器中加入适当溶剂后破碎，而得以提取有效成分21。有关研究表明，此法提取速度快且完全，不需加热，可以节省时间、能源和溶剂，这种方法虽然省时且不用高温加热，但由于其提取率并非最高而使其只局限于实验研究。 1.7 酶法提取酶法提取是通过酶解反应强化传质过程，从而提高提取效率。酶解是一种能够最大限度从植物体内提取有效成分的方法之一22。中药的有效成分经常与蛋白质、果胶、淀粉、植物纤维等杂质混合，这些杂质不但影响植物细胞中活性成分的浸出，而且影响中药液体制剂的澄清度。选择恰当的酶，不但可以将这些杂质祛除，而且可以通过酶反应较温和地将植物组织分解，加速有效成分的释放提取，还可以促进脂溶性成分转化为易溶于水的成分而有利于提取。 综上所述，为缩短提取时间，提高产率，对于中药有效成分已知的研究，仅需采取最适当的方法进行提取；对于中药有效成分未知的研究，可采用对照的方法，采用不同的提取方法，尽可能完全提取出有效成分。2. 高效液相色谱法简介 2.1 高效液相色谱法的简介高效液相色谱法(High-Performance Liquid Chromatography，HPLC)是以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术23。高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析，高效液相色谱已经广泛应用于药物的含量测定、组成分析、质量控制等方面。 2.1.1 高效液相色谱的特点 (1) 高压：流动相为液体,流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。(2) 高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。(3) 高灵敏度：紫外检测器可达0.01 ng，进样量在L数量级。(4) 应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。(5) 分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15-30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成，一般小于1 h。 2.1.2 液相色谱的分离原理和分类根据被分离混合物中各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离，其实质是试样分子与流动相或洗脱液以及固定相分子间的作用力，作用力的大小决定色谱过程的保留行为21。根据分离机制的不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化学键合相色谱、离子交换色谱和分子排阻色谱。 2.2 高效液相色谱法的应用 由于HPLC具备了高灵敏度、高分辨率、速度快、色谱柱可反复使用、流出组分易收集的特点。使得它在生化、有机化学、医学药物临床、化工、环保监测等方面都有广泛的用途24。例如：（1）药物分析：中药质量控制，化学药物质量控制，抗生素质控分析，生化药质量控制，新型高效手性药物中手性对映体含量的测定等。（2）环境污染物分析：大气、水、土壤和食品中的多环芳烃、多环联苯，阴离子表面活性剂，有机氯农药、有机磷农药，除草剂，酚类胺类、黄曲霉毒素等污染物的分离与测定。（3）食品质量分析：农药残留，兽药残留；防腐剂、抗氧化剂、人工合成色素等食品添加剂的分离与测定，保健食品中的功效成分检测，真菌毒素分析等。（4）前沿生命科学分析：DNA电泳与色谱分析，生物技术药物纯化及鉴定，生物标志物色谱分析，蛋白质组学研究等。3. 羌活性状及药理作用研究为圆柱形略弯曲的根茎，长4-13 cm，直径0.6-2.5 cm，顶端具茎痕。表面棕褐色至黑褐色，外皮脱落处呈黄色。节间缩短，呈紧密隆起的环状，形似蚕（习称蚕羌）；或节是延长，形如竹节状（习称竹节羌）。节上有多数点状或瘤状突起的根良及色破碎鳞片。体轻，质脆，易折断。断面不平整，有多数裂隙，皮部黄棕色至暗棕色，油润，有棕色油点，木部黄白色，射线明显，髓部黄色至黄棕色。气香，味微苦而辛。羌活不同部位如图3-1至3-3所示： 图3-1羌活茂盛植株 图3-2晾干的羌活茎 图3-3晾干的羌活根部 3.1 羌活性状 羌活药材因药用部分和形态不同而有蚕羌、竹节羌、大头羌、条羌等数种。蚕羌又名：螺丝羌。为干燥的根茎部，形态似蚕。呈圆柱状或略弯曲，长约4-10 cm，直径约1-2 cm。顶端有茎叶残基。表面棕褐色，有多数紧密而隆起的环节。节上密生疣状突起的须根痕。质轻松易折断，断面不齐，有明显的菊花纹和多数裂隙，皮部棕红色；木质部淡黄色，中央有黄白色髓，均有朱砂点（油管），具特殊香气，味微苦而麻；竹节羌：根茎的环节较稀，如竹节状，似蚕羌而略大；大头羌：根茎的环节特别膨大，呈不规则团块状，大小不等，顶端具多数残留茎基，余皆与蚕羌相同；条羌：为干燥的根及支根。呈圆柱形或分枝，长3-17 cm，直径约0.7-1.7 cm，顶端偶可见有根茎，表面棕褐色，有纵纹及疣状突起的须根痕，上端较粗大，有稀疏隆起的环节，质疏松而脆、易折断，断面不平坦，皮部浅棕色，木部黄白色，有菊花纹，朱砂点不明显，中央无髓，气味较淡薄。 3.2 主要成分 羌活中含有的化学成分主要有挥发油、香豆素、氨基酸、有机酸和甾醇等25 。挥发油主要含有Ot-蒎烯(Otpinene)、B-蒎烯(3-pinene)、柠檬烯(1imonene)等63种；香豆素类化合物主要含有异欧芹素乙(isoiinperatorin)、佛手柑内酯(ber-gapten)、佛手柑亭(bergamotin)、佛手酚(bergapto1)、羌活酚(notopto1)、羌活醇(notoptero1)、脱水羌活酚(anthydronotopt01)、乙基羌活醇(ethylnotoptero1)、羌活酚缩醛(notoptolide)、环氧脱水羌活酚(anhydronotoptoloxide)和紫花前胡苷(nonak-enin)等；糖类主要有鼠李糖、果糖、葡萄糖和蔗糖；氨基酸有19种；还含有阿魏酸(ferulic acid)、茴香酸对羟基苯乙酯(P-hydroxyphenethyl anisate)等有机酸及有机酸酯；此外，羌活中还含有B-谷甾醇(B-sitostero1)、娠烯醇酮(prenenolone)、镰叶芹二醇(fmcarindio1)等类化合物 。主要成分的结构如图3-4至3-6所示： 图3-4 阿魏酸分子结构图 图3-5 香豆素母体结构 图3-6 异欧前胡素分子结构图 3.3 药理作用（1）急毒性研究及抑菌抗病毒作用 研究表明，发现羌活对流感病毒肺炎小鼠的死亡具有保护作用，高剂量组能直接杀死小鼠肺部的流感病毒。同时有报道表明，羌活中有的镰叶芹二醇具有明显的抑菌作用，可抑制金黄色葡萄球菌的生长，并可用来防治特应性皮炎；研究测得羌活最小抑真菌浓度(MIC)为11.88%。（2）解热消炎镇痛作用 汤液本草中记载：“羌活气雄，治足太阳风湿相搏，头痛，肢体痛，一身尽痛者，非此不能除。”由此可见，古人就用羌活作为镇痛药。现代医学对羌活的解热消炎镇痛作用进行了大量的研究：给大鼠灌服大剂量的羌活挥发油1.328 mL/kg体重和腹腔注射0.133 mL/kg体重，可使酵母引起的发热现象明显改善26；羌活中含有的乙酸乙酯具有镇痛作用27。羌活水提物对迟发型变态反应诱导的肝损伤、酵母多糖诱导的腹腔白细胞游出和胶原蛋白诱导细胞分泌基质金属蛋白酶等具有显著的抑制作用28。（3）抗血栓作用资料表明27，羌活主要是通过抑制血小板和红细胞聚集，降低血液黏度产生抗血栓形成作用，因此推测苯乙基阿魏酸酯和(-)-冰片基阿魏酸酯可能是羌活抗血小板聚集的活性成分。张明发等29研究指出，0.100 g/mL羌活醇提取物可延长凝血时间。（4）抗心律失常作用 羌活小分子、大分子水溶液抗心律失常作用的最佳使用浓度分别为12和22 g/mL30。羌活水提物能明显缩短氯仿一肾上腺素引起的兔心律失常的挣续时间成伊竹等 研究指出，当羌活小分子水溶液浓度为l2 kg时，能在短时问恢复正常心律。口服羌活提取物能延长乌头碱致大鼠心律失常的出现时间，提高哇巴 致豚鼠室颤和心搏停止的用量，降低大鼠缺血再灌注诱发的室早、室速和室颤的发生率31。 另外，羌活还具有改善学习记忆障碍和抗过敏作用。有研究表明31，羌活中的紫花前胡苷具有改善学习记忆障碍的功能，表明紫花前胡苷有望发展成为新的预防和治疗健忘症药物。 4. 实验部分 4.1 实验仪器Agilent1100 HPLC仪(美国安捷伦科技有限公司)；Unimicro HPLC泵；Unimicro色谱工作站；Redone 7725i定量进样阀；HH-6型数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；KQ3200型超声清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；FZ102型微型植物粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。 4.2 试剂与材料用于样品提取的试剂(水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯)为分析纯试剂（天津试剂三厂）；用于HPLC检测的试剂(甲醇、0.1%磷酸)为色谱纯试剂；实验用水为纯净水。羌活药材为市售精品药材。 4.3 色谱条件色谱柱：YMC ODS-A C18柱（250 mm4.6 mm I.D,5 m）；流动相：甲醇：0.1%磷酸水溶液(v/v)，0-30 min 30%-45%甲醇-0.1%磷酸水溶液混合液梯度洗脱；柱温：室温；进样量：20 L；流速：1.0 mL/min；检测波长：330 nm。 4.4 提取过程将羌活粉碎，分别按照以下步骤进行提取。 4.4.1 不同提取方法的比较(1) 精确称取羌活药材粉末1.939 g，于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL无水乙醇，超声提取0.5 h。(2) 精确称取羌活药材粉末2.0035 g，于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL无水乙醇，冷浸0.5 h。 (3) 精确称取羌活药材粉末1.9993 g，于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL无水乙醇，设定温度为80 加热回流0.5 h。提取液过滤后，置于10 mL容量瓶中，用乙醇定容，通过0.45 m膜过滤，待测。 4.4.2 不同提取溶剂的比较(1) 精确称羌活药材粉取末1.9993 g，于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL无水乙醇，加热回流0.5 h。(2) 精确称羌活药材粉取末2.0078 g，于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL甲醇，加热回流0.5 h。(3) 精确称羌活药材粉取末2.0094 g，于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL乙酸乙酯，加热回0.5 h。(4) 精确称羌活药材粉取末2.0331 g，于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL水，加热回流0.5 h。 无水乙醇、甲醇提取液经过滤后，分别置于10 mL容量瓶中，用乙醇、甲醇定容；乙酸乙酯提取液需旋干后置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，通过0.45 m膜过滤，待测。 4.4.3 不同浓度甲醇的比较(1) 精确称羌活药材粉取末2.0014 g，于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL30%甲醇，加热回流0.5 h。(2) 精确称羌活药材粉取末2.0413 g，于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL50%甲醇，加热回流0.5 h。(3) 精确称羌活药材粉取末2.0165 g，于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL70%甲醇，加热回流0.5 h。(4) 精确称羌活药材粉取末2.0238 g，于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL90%甲醇，加热回流0.5 h。(5) 精确称羌活药材粉取末2.0363 g，于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL100%甲醇，加热回流0.5 h。 提取液过滤后，置于10 ml容量瓶中，用甲醇定容，通过0.45 m膜过滤，待测。 4.4.4 不同提取次数的比较(1) 精确称羌活药材粉取末10.0316 g，于100 mL圆底烧瓶中，加入50 mL甲醇，加热回流第一次，回流0.5 h。(2) 取第一次回流抽滤后羌活药材粉末于100 mL圆底烧瓶中，加入50 mL甲醇，加热回流0.5 h。(3) 取第二次回流抽滤后羌活药材粉末于100 mL圆底烧瓶中，加入50 mL甲醇，加热回流0.5 h。(4) 取第三次回流抽滤后羌活药材粉末于100 mL圆底烧瓶中，加入50 mL甲醇，加热回流0.5 h。提取液过滤后，置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容，通过0.45 m膜过滤，待测。5. 结果与讨论5.1 HPLC分离条件的优化为使目标化合物羌活有效成分获得较好的分离效果，使用甲醇-0.1磷酸水溶液为流动相梯度洗脱各组分分离情况如图5-1、5-2、5-3所示： 图5-1 羌活于甲醇-0.1%磷酸水溶液(v/v)，0-40min10%-100%的HPLC图 色谱条件：色谱柱：YMC ODS-A C18柱（250 mm4.6 mm I.D,5 m）；检测波长：330 nm ；流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液(v/v)，0-40min10%-100%；流速:1.0 mL/min；进样量:20L。图5-2 羌活于甲醇-0.1%磷酸水溶液(v/v)，0-15 min36%-48%HPLC图 色谱条件：色谱柱：YMC ODS-A C18柱（250 mm4.6 mm I.D,5 m）；检测波长：330 nm ；流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液(v/v)，0-15 min36%-48%；流速:1.0 mL/min；进样量:20L。图5-3 羌活有效成分HPLC图 色谱条件：色谱柱：YMC ODS-A C18柱（250 mm4.6 mm I.D,5 m）；检测波长：330 nm ；流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液(v/v)，0-30 min30%-45%；流速:1.0 mL/min；进样量:20L。结论：由图5-1、5-2、5-3比较知，图5-3分离效果较好。且根据文献和峰面积及保留时间的比较可推测这四种物质为：I阿魏酸、II羌活醇、III苯乙基阿魏酸酯、IV异呕前胡素。 5.2 不同提取方法的比较为了考察不同提取方法对于提取效率的影响，使用无水乙醇为提取溶剂，分别采用冷浸提取0.5 h、超声提取0.5 h、加热回流（80）提取0.5 h。提取液经抽滤瓶真空过滤后，用HPLC分析，结果如图5-4所示：图5-4 不同提取方法下各有效成分的峰面积比较图由图5-4可以看出：采用相同的提取溶剂，不同的提取方法对提取效率也有显著的影响，其中的加热回流提取效率最高，超声次之，冷浸的提取效率最低。5.3 不同提取溶剂提取效率的比较为了选择合适的提取溶剂，分别加入水、甲醇、乙酸乙酯、无水乙醇为提取溶剂加热回流提取0.5 h，提取液经抽滤瓶真空过滤，0.45m膜过滤后用HPLC分析，结果如图5-5所示：图5-5不同提取溶剂下各有效成分的峰面积比较图由图5-5可以看出：在相同提取方法及提取时间下，提取溶剂的种类对提取效率影响非常显著，其提取效率由高到低依次为甲醇、乙醇、水、乙酸乙酯。故纯甲醇为最优提取溶剂。 5.4 不同浓度甲醇提取效率的比较为了选择乙醇合适的提取浓度，分别加入100%甲醇、90%甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇为提取溶剂加热回流提取0.5 h，提取液经抽滤瓶真空过滤后，用HPLC分析，结果如图5-6所示：图5-6不同甲醇浓度下各有效成分的峰面积比较图 由图5-6可以看出：溶剂浓度对提取成分的提取率有较大影响，纯甲醇提取效果是最好的。5.5 不同提取次数提取效率的比较为了考察提取次数对于提取效率的影响，使用甲醇为提取溶剂，分别将药品连续加热回流提取0.5 h四次，提取液经抽滤瓶真空过滤后，用HPLC分析，结果如图5-7所示：图5-7不同提取次数下各有效成分的峰面积比较图从以上数据可以看出：使用甲醇为提取溶剂，随提取次数的增加，提取物中有效成分的含量逐渐降低，提取次数为三次时就能将生物碱提取完全。故采用纯甲醇加热回流3次，每次0.5 h为最佳提取工艺。 结论（1）本文对羌活中有效成分的提取进行了研究，并运用高效液相色谱法进行了分离、分析。所建立方法简便，快速，灵敏度高，显示了高效液相色谱法在中药分析中有较大优势。（2）本实验通过采用冷浸、超声和加热回流提取三种方法，考察了不同提取方法对于提取效率的影响，结果表明加热回流效率最高；通过采用甲醇、乙醇、乙酸乙酯、水为提取溶剂，结果表明甲醇为最佳提取溶剂；通过采用30%、50%、70%、90%、100%浓度甲醇进行提取，结果表明纯甲醇效果最好；通过采用提取次数对于提取效率的影响，用纯甲醇连续提取4次，结果表明用纯甲醇回流3次羌活中有效成分就能提取完全。由此建立了羌活有效成分的最佳提取工艺为：以纯甲醇为提取溶剂加热回流提取3次，每次0.5 h。参考文献1 王幼平，溥发鼎，王萍莉等中国特有属-羌活属的系统分类研究J.云南植物研究，1996,18(4):424-430.2 国家药典委员会中国药典S.北京：化学工业出版社，2005,127.3 饶高雄，杨祺，戴万生中药独活、羌活的本草沿革和植物来源J.云南中医学院学报，1994,17(4):11-16.4 徐国钧，徐珞珊，王峥涛常用中药材品种整理和质量研究，第3册M.福建科学技术出版社，1997,191-228.5 孙辉，蒋舜媛，陈士林等高寒山区濒危药用植物羌活产地适宜性及生产区划分析J.中国中药杂志，2009,34(5):535-538.6 蒋舜媛，孙辉，周毅等宽叶羌活适生地分析及数值区划研究J.中草药，2009,40(4):638-643.7 钟革正交实验法优选羌活挥发油的提取工艺J.中国现代药物应用，2008,2(11):26-27.8 蒋合众，李芬，刘春光等羌活挥发油SFE.C02提取工艺研究J.安徽农业科学，2008,36(5):17409 胡敏敏，蔡宝昌，张志杰等两种方法提取羌活挥发油化学成分的比较J.中医药学刊，2006,24(10):1931-1932.10 徐国钧，徐珞珊，王峥涛常用中药材品种整理和质量研究，第3册福建科学技术出版社，1997,190-228.11 肖永庆，孙友富，刘晓宏羌活化学成分研究J.中国中药杂志，1994,19(7):421.12 李丽梅，梁宝德，俞绍文等羌活的化学成分J.中国天然药物，2007,5(5):35l-354.13 王曙，王天志宽叶羌活化学成分研究J.中国中药杂