患病鲫肾组织中病毒解旋酶基因的检测

学号：学号：071040132 本科毕业论文本科毕业论文 患病鲫肾组织中病毒解旋酶基因的检测 院 （系）： 生物科学与技术学院 专 业： 生物工程 姓 名： 李 涛 班 级： 0710401 指导教师： 周毅峰 副教授 中国恩施 二一四年五月 Student ID： 071040132 BACHELORS THESIS OF HUBEI UNIVERSITY FOR NATIONALTIES Detection the herpesviral helicase gene from the diseased gibel carp Carassius carassius Name： Tao Li Grade： 0710401 Profession：Biological engineering Tutor：Coprof. Yi-Feng Zhou Enshi China May, 2014 学术声明学术声明 1、始终以“求真、务实、创新”的科学研究态度从事各项研究工作。 2、在本论文中，除了已经标注的所有引用文献以为，其他所有均为自己试 验真实结果。 3、在本论文中除了已经标注了的引用文献外，没有包含任何人或者机构的 科研成果。 4、对本论文作出帮助和贡献的同志，在文章中做了声明并感谢。 5、本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 年 月 日 导师审核声明导师审核声明 本人郑重声明：该学生所写学士学位毕业论文，是在本人的指导下完成。其 中文字、图、表及其它相关内容均经本人审核，同意作为该生的学位论文提交。 导师签名： 年 月 日 患病鲫肾组织中病毒解旋酶基因的检测 李涛 (湖北民族学院生物科学与技术学院，恩施，445000) 摘 要：为查明部分养殖场鲫患出血病的病原，结合体表症状、病变组织及鱼疱 疹病毒基因序列，进行了形态解剖、PCR及RT-PCR检测以及病毒回接感 染，初步分析了引起鲫出血病的病原。结果表明：三十尾患病鲫体表， 尤其是腹部出现点状出血点，解剖后观察到肝脏、肾脏、脾都有充血型 肿胀，肠肿胀变粗。PCR扩增患病鲫基因组DNA和RT-PCR扩增患病鲫肾 转录组均出现一条约360bp特异性片段，和预测362bp片段大小基本相符， 证实了该患病鲫肾中含疱疹病毒解旋酶基因，回接感染三天左右鱼腹部 开始出现点状出血点，四天左右鱼开始死亡。因此，推测疱疹病毒与鲫 出血病有关原因之一，其它因素是否与鲫出血病有关有待进一步实验证 实。 关键词：鲫；鱼疱疹病毒；PCR；RT-PCR；出血病 Detection the herpesviral helicase gene form the diseased gibel carp Carassius carassius Tao Li (School of biologic science and technology,Hubei university for nationalities, Enshi, 445000) Abstract：In order to indentify the causative pathogen of the disease with severe hemorrhages has emerged in some farms of central China. The gross pathological signs were observed and observation of the external surface of tens of diseased gibel carp showed severe dotted hemorrhages on the body surface, especially on the abdomen. Anatomy inspection showed that liver, kindey, spleen and intestine all presented symptoms of swelling. The target gene was amplified with the designed primer by the PCR method. The PCR product was analyzed by agarose gel electrophoresis and a specialized fragment was observed with 360bp, which matched the size of the target gene about 362bp, indicating that the gene of helicase of herpesvirus existed in the kidney of diseased fish. Tieback infected fish belly began to appear about three days spotting points, about four days the fish began to die.The present study showed that the DNA and RNA of helicsase of fish herpesvirus from diseased fish have been detected, and this result indicated that fish herpesvirus was related to the disease of hemorrhages for diseased gibel carp. However, further studies are needed to demonstrate this result. Key words：Gibel carp;Hemorrhagic disease;Fish herpes virus;PCR; RT-PCR 目 录 1 引言.2 1.1 研究背景.2 1.2 鱼病毒病检测方法.2 1.2.1 细胞培养检测.2 1.2.2 分子生物学检测.2 1.3 疱疹病毒.3 1. 3.1 疱疹病毒的形态和种类3 1.3.2 鱼和水产动物疱疹病毒.3 1.3.3 鱼感染疱疹病毒.4 1.4 鲫出血病.4 1.4.1 病毒性出血病和细菌性出血病的区别.4 1.4.2 出血病的防治.4 1.5 本研究的目的与意义5 2 材料与方法.6 2.1 材料.6 2.2 试剂与设备.6 2.2.1 试剂.6 2.2.2 主要设备.6 2.3 方法.6 2.3.1 DNA 的提取6 2.3.2 PCR 扩增.7 2.3.3 PCR 引物的设计.7 2.3.4 RNA 提取7 2.3.5 RNA 逆转录8 2.3.6 RT-PCR 扩增9 2.3.7 琼脂糖凝胶电泳检测.9 2.3.8 病毒的回接感染.10 2.4 结果分析10 2.4.1 体表观察及解剖观察.10 2.4.2 回接感染.11 2.4.3 分子生物学检测.11 参 考 文 献.12 致 谢.14 2 1 引言 1.1 研究背景 鲫(Carassius carassius)在我国乃至世界上都是人们非常重要的食用的鱼类之 一，不仅其肉质细嫩，肉味甜美，而且还含有丰富的营养，因为其生长环境，所 以鲫含有钙等大量的矿物质，鲫不但营养价值很高，而且药用价值也很高，具有 和中补虚、温胃、补中气等功效。但遗憾的是在鲫的养殖过程中，时常会有病害 发生。 微生物病原引起鱼类患病的主要有四大类1：一是病毒 （如虹彩病毒2、弹 状病毒3、呼肠孤病毒4及疱疹病毒等） ；二是细菌；三是真菌；四是寄生虫。在 这些微生物病原中，病毒的个体微小，能够侵入宿主的细胞内，有些病毒有很长 的潜伏期，这样就使得由于病毒患病的病症十分复杂，一旦发病传染率很高，导 致大量鱼体死亡，在水产养殖上造成了严重的威胁，易造成巨大的经济损失。因 而病毒病的早期检测就显得非常重要。 1.2 鱼病毒病检测方法 1.2.1 细胞培养检测 细胞培养技术的发明，为病毒学的研究开打下了坚实的基础，也为病毒病的 检测提供了一种经典的方法，体外培养技术不仅对于病毒学的研究有很重要的意 义，对于整个生命科学的研究都有很重要的意义，不仅是进行水生病毒病原分离 鉴定的前体条件，还可以用于遗传分析、病毒滴度测定以及药物筛选。张奇亚等 5经过多年研究，建立了20多种鱼类的腮、鳍、性腺、肾脏等细胞系。张奇亚等6通 过建立呈上皮细胞形态的草鱼椎骨间质细胞系GCVB，表明GCVB细胞对蛙虹彩 病毒中国分离株RGV9506及蛙虹彩病毒美国分离株FV3敏感，可引起不同程度的 病变。 1.2.2 分子生物学检测 3 分子生物学技术主要应用聚合酶链反应(PCR)和逆转录 PCR，是一项 DNA 在 体外合成的放大技术。在急性发病和痊愈时期的鱼组织中，用 PCR 法检测病毒 DNA 是一种最有效的方法。 刘世超8采用Nested-PCR检测方法对我过江苏、南京、浙江等城市的食用鲫 和鲤进行了锦鲤疱疹病毒流行病的分子生物学检测，在南京等8个城市或者地区 检测出锦鲤疱疹病毒基因的存在。张振国9等通过建立KHV双重PCR检测的方法， 快速诊断出患病锦鲤体中包含的锦鲤疱疹病毒(KHV)，建立了一个简单、方便、 快捷、灵敏、准确的方法。孟建峰10等利用PCR技术选择三个主要靶基因(胸苷激 酶基(TK)、聚合酶基因(Sph)和(ORF7 基因)快速检测出锦鲤疱疹病毒。 黄世旺11等采用RT-PCR技术，通过从GeneBank中下载能水痘带状疱疹病 毒和肠道病毒基因序列，在其保守区设计引物建立RT-PCR体系，进行扩增，够 快速检测出水痘带状疱疹病毒(VaricellaZoster virus)和肠道病毒(Enteroviruses)， 此方法操作简单、效率很高、灵敏度高、省时。 1.3 疱疹病毒 1. 3.1 疱疹病毒的形态和种类 疱疹病毒(herpesviral)毒粒的直径为100120 nm12，一般为球形，外面有糖蛋 白组合而成的囊膜。疱疹病毒性在病毒中属于一群中等大小的dsDNA病毒，在宿 主细胞内增殖速度非常快，而且还可以引起宿主细胞的病变，其生长的周期还很 长，这样就可以导致宿主细胞形成巨细胞，感染淋巴细胞，从而引起淋巴增生等 致病特性。 疱疹病毒科被分为3个亚科：(1)疱疹病毒亚科，其中包括单纯疱疹病毒属、 水疱疹病毒属、喉气管炎病毒属、马立克病毒属和沟鲶病毒属。(2)疱疹病毒亚 科，其中包括巨细胞病毒属、老鼠细胞巨型病毒属和玫瑰疱疹病毒属。(3)疱疹 病毒亚科，其中包括淋巴潜隐病毒属和猴病毒属。现已从不同鱼中检测到多种疱 疹病毒或者类似疱疹病毒12。 1.3.2 鱼和水产动物疱疹病毒 疱疹病毒在自然界分布广泛，感染对象也很广泛，其中包括禽类（鸡） 、哺 乳类（人、猴、 猪、马、牛）等，而且还能感染鱼类和其它水生动物（如两栖 类（蛙） 、江豚等）13。疱疹病毒性造血器官坏死病是一种能够引起鲫（金）鱼 4 高致病的病毒病，最开始定义为造血器官坏死病毒，后面也有称作疱疹病毒性造 血器官坏死病病毒14。病毒性出血病性败血症是一类严重的病毒性病症，感染鱼 类病毒性出血病性败血症的鱼发病迅速，死亡率高达70%90%12。 1.3.3 鱼感染疱疹病毒 在脊柱动物中普遍存在疱疹病毒的宿主特异性病原体。基因组序列表明，大 多数鱼疱疹病毒和两栖动物疱疹病毒被组合在一起，而远亲的爬行动物、鸟类和 哺乳动物疱疹病毒被组合在一起。然而，许多 疱疹病毒成员的生物学过程是相 似的。其中最大的特点是病毒粒子的结构、复制过程都比较保守，能够建立长期 延迟和宿主免疫反应的操作。许多的类似的过程，可能是由于趋同进化。许多异 基因疱疹病毒的生物学知识是从两个物种的研究得出：疱疹病毒1（斑点叉尾鮰 病毒）和鲤科疱疹病毒3（锦鲤疱疹病毒）15。 鱼疱疹病毒分为三类，包括主要感染锦鲤的锦鲤疱疹病毒(KHV)16、造成金 （鲫）鱼疱疹病毒性造血器官坏死病(HVHN)的鲤科疱疹病毒2(CyHV-2)17和鲤疱 疹病毒3(CyHV-3)18.。 1.4 鲫出血病 1.4.1 病毒性出血病和细菌性出血病的区别 病毒性出血病：表现为肌肉内的出血，用镊子剥去表皮之后，就可以看见在 肌肉上有点状或者是块状的有的甚至还会出现全身的肌肉都充血、出血，鳍条出 血的部位都会靠近肌肉的根部。细菌性出血病：出血只会表现在表皮，不会存在 肌肉出血，用镊子剥去表皮之后，可以看见肌肉颜色正常，鳍条出血主要出现在 鳍条的末端。细菌性赤皮病表现往往出现会鳞片脱落、鳍条糜烂等，出血区域呈 块状分布19。 1.4.2 出血病的防治 鱼出血病死亡率高，造成损失大，防止工作就格外重要。首先应该做好养 殖场的水质的检测与观察，及时检测出病原，以便于采取措施进行防治。其次必 须清除池塘淤泥，将其彻底清洗干净，做到定期消毒和杀虫。治疗时配合外用消 毒剂和内服的饵料同时进行20。 6至9月是鱼发病的高峰期，池塘中很容易出现爆发性鲫出血病，并且还会危 害其他鱼类，给养殖户带来重大损失。刘诗训21通过多年的反复观察与治疗，总 5 结出一套预防鲫出血病大规模爆发的方法：用呋喃唑酮或土霉素制成的药饵连 续喂养。用0.5ppm强氯精加水稀释后泼洒全池。采用混合治疗，喂药和泼洒 结合使用。采用综合治疗，使用烟叶、敌杀死、板蓝根泼洒。 1.5 本研究的目的与意义 近些年有部分水产养殖场出现鲫患出血病的情况，造成了鲫的大量死亡，严 重影响鲫的产量和质量。但是现在还没有研发出任何能够有效治疗鱼类病毒病的 药物，所以对养殖时期鲫出血病的检测就显得尤为重要。因此，在病理病症以及 分子生物学的基础上建立一套比较完善的检测体系，对于预防病害的发生，减少 养殖户的损失有着十分重要的意义，这样就可以更好的提高鲫市场供应量和供应 鲫的质量。 6 2 材料与方法 2.1 材料 患病鲫肾脏组织 2.2 试剂与设备 2.2.1 试剂 蛋白酶 K、逆转录酶、无水乙醇、三氯甲烷、异戊醇、饱和酚、十二烷基硫 酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、Taq Buffer、MgCl2、PrimerF、PrimerR、10Buffer、RNA Inhibitor、dNTP、Taq polymerase、dd H2O、EB、Loading Buffer、TBE、TBSDEPC、 2.2.2 主要设备 离心机 Sigma)、灭菌锅(Hirayama)、GBOX 全自动凝胶成像系统(Syngene)、 PCR 仪(Applied Biosystems)、电泳仪（北京市六一仪器厂） 、0.4m 滤膜 2.3 方法 2.3.1 DNA 的提取22 病毒基因组 DNA 是直接从患病鲫肾脏中提取，按照常规的酚/氯仿抽提法进 行，具体步骤简述如下： (1) 取组织解冻，生理盐水冲洗，称取 0.5g 左右组织，剪碎后装入 1.5ml 离 心管中； (2) 加入 400l 10mM Tris-HCL、1mM EDTA 、1% SDS 混合 pH=8.0 的细胞 裂解液和蛋白酶 K，57水浴 2 小时，混合液澄清后进行后续步骤； (3) 加入 400l苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)混合液混合均匀，在 4 12000g 条件下离心 5min； (4) 取上层水相，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)混合液，混合均匀，重复 抽提一次，在 4 12000g 条件下离心 5min； (5) 取上层水相，然后加入 1/10 体积的 NaCl 和二倍体积的预先冷处理的无 水乙醇，沉淀 DNA，观察现象，之后将其置于-20过夜沉淀 DNA； 7 (6) 在 4、15000g 条件下离心 10min，离心后去除上清液，管底沉淀用 70% 乙醇洗涤一次，然后再在 4、15000g 条件下离心 10min，去除上清液，将离心 管放入 37烤箱中干燥几分钟，最后加入约 20l 无菌水溶解 DNA。 2.3.2 PCR 扩增7 以提纯后稀释的病毒基因组 DNA 作为模板，分别以 Primers F/R（引物序列 见表 2-3）为引物进行 PCR 扩增。PCR 反应体系及反应程序表 2-1 和表 2-2 表 2-1 PCR 反应体系 Table 2-1 System of PCR reaction 编号 试剂 体积(l ) 1 dd H2O 17 2 Taq Buffer 2.5 3 MgCl2 2.5 4 dNTP 0.5 5 PrimerF 0.5 6 PrimerR 0.5 7 Taq polymerase 0.5 8 DNA 1 Total 25 表 2-2 PCR 反应程序 Table 2-2 Progress of PCR reaction 步骤 温度() 时间 1 94 4min 2 94 30s 3 56 30s 4 72 30s 5 Go to Step#2 30cricle 6 72 10min 7 10 10min 待反应结束后将 PCR 反应得到的产物进行 1%的琼脂糖凝胶电泳，用 EB 溶 液染色 3-4min 后放入凝胶成像系统中观察并保存结果。 2.3.3 PCR 引物的设计23 从 NCBI Gene Bank 中查询到到鱼疱疹病毒的基因序列之后，再用 Primer Premier 5.0 软件设计引物，得到一对引物(表 2-3) 表 2-3 用于扩增鱼疱疹病毒解旋酶基因的引物 Table 2-3 Primers used to amplify to helicase gene of fish herpesvirus Primers Primers sequences(5-3) F GGACTTGCGAAGAGTTTGATTTCTAC R CCATAGTCACCATCGTCTCATC 2.3.4 RNA 提取24 8 (1)用电子天平秤取 0.03g 肾脏样品，然后向里面加入 1ml Trizol，用玻璃棒研 磨，室温静止 5min； (2)将组织裂解液转入 1.5ml 离心管中，然后向管中加入 0.2ml 氯仿，剧烈震荡 15s，室温静止 3min； (3)在 12000g、4条件下离心 15min，此时会发现管内的溶液会分为三层，其 中最上层的是水相，下层的为有机相，而这时候 RNA 存在于上层的水相中间， 用移液枪小心的将上层水相转移到另一个离心管中。 (4)向管中加入 500l 的异丙醇，轻轻颠倒混合均匀，然后放在室温下静止 10min； (5)在 12000g、4条件下离心 10min（离心前看不见任何沉淀物质，离心后管 壁或者管底出现胶装沉淀） ； (6)离心后去除上清液，然后向管中加入 1ml 75%乙醇，混合均匀； (7)在 4、7500g 条件下离心 5min，去除乙醇溶液，将管放在空气中干燥约 10min。 (8)加入 20lDEPC-H2O 溶解 RNA。 2.3.5 RNA 逆转录25 取 10lRNA 加入到 0.2ml 离心管中，再加入 1l 随机引物，在 PCR 仪中 70 条件下保温 5min，保温结束后，迅速放入冰上冷却。逆转录体系及反应程序表 2- 4 和表 2-5 表 2-4 逆转录体系 表 2-5 逆转录反应程序 Table 2-4 System of Reverse Transcription Table 2-5 Progress of Reverse Transcription 编号 试剂 体积(l) 1 DEPC- H2O 6.5 2 Reverse transcripatase 1 3 dNTP 1 4 buffer 5 5 RNA inhibitor 0.5 6 RNA 11 Total 25 步骤 温度() 时间 1 37 1h 2 94 5min 3 4 30min 9 2.3.6 RT-PCR 扩增7 以逆转录的 cDNA 为模板，以 Primers F/R（引物序列见表 2-3）为引物进行 RT-PCR 扩增。 RT-PCR 反应体系及反应程序表 2-6 和表 2-7 表 2-6 RT-PCR 反应体系 Table 2-6 System of RT-PCR reaction 编号 试剂 体积(l) 1 dd H2O 19.5 2 10Taq Buffer 2.5 3 dNTP 0.5 4 Primer F 0.5 5 Primer R 0.5 6 Taq polymerase 0.5 7 cDNA 1 Total 25 2.3.7 琼脂糖凝胶电泳检测26 (1)1%浓度琼脂糖凝胶的制作。用量筒量取 20ml 0.5 TBE 缓冲液，倒入三角 瓶中，然后在电子天平上称取 0.2g Agarose 粉末倒入缓冲液中，将三角瓶放入微 波炉中加热融化 Agarose 粉末。融化完成后，将三角瓶放在室温下冷却 3-5min， 然后将融化的琼脂糖凝胶倒入已准备好的模板中。 (2)大约30-40min) 后待凝胶完全凝固，双手小心的拔去梳子，将胶放入电泳槽 中，若TBE缓冲液未没过胶面，则需要加入TBE缓冲液。 (3) 将样品与加样Loading buffer缓冲液混合后, 用移液枪缓慢加入点样孔中。 具体加入的样品的量与加样Loading buffer缓冲液的量要根据样品的数量及片段大 小和加样孔径的大小而确定, 一般加入8l左右。 (4)打开电泳仪，设置电压198V、电流98mA、电泳时间20min，开始进行电泳。 表 2-7 RT-PCR 反应程序 Table 2-7 Progress of RT-PCR reaction 步骤 温度() 时间 1 94 4min 2 94 30s 3 56 30s 4 72 45s 5 Go to Step#2 32cricle 6 72 10min 7 10 10min 10 (5)电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，将其放入EB溶液中染色，大约染色5- 8min。 (6)打开GBOX全自动凝胶成像系统，将染色的琼脂糖凝胶放入其中，打开软 件，观察电泳结果。 2.3.8 病毒的回接感染27 (1)将患病鱼体进行解剖，取出鱼体肾脏、脾、肝脏和头肾，放入已经灭菌的 研钵中研磨。 (2)充分研磨之后按照 1:10 比例加入 PBS 缓冲液，将混合液小心转入到三角瓶 中，将三角瓶放入冰箱中反复冻融，让细胞能够破碎，使病毒粒子能够释放出来。 (3)将混合液进行离心，取出上清液，去除底部杂质。 (4)用0.4m 滤膜对上清液进行过滤，去除细菌等杂质。 (5)将过滤后的滤液用注射器，从正常鱼体腹鳍处注射入正常鱼体体内。 (6)将鱼放入氧气充足，水温25条件下进行养殖。 2.4 结果分析 2.4.1 体表观察及解剖观察 通过目测患病体表特征显示，在鱼体体表尤其是腹部出现点状出血点(图 2- 1A)。将鱼体解剖后观察到鱼体腹腔内有大量腹水，鱼的肝脏、肾脏、脾和肠道 都有不同程度的病变，如脾和肾都有充血型肿胀，肠肿胀变粗。鱼腮上有上有出 血(图2-1B)。和田飞炎14等观察到在临床症状和病理特征相符，因此将其定性为 鲫出血病。 11 图2-1 患病鲫 Fig.2-1 diseased gibel carp A 为患病鲫体表观察图，在鱼体的腹部出现出血点；B 为患病鲫解剖观察图，在 鱼体解剖后可以看见鱼体的内脏有充血型肿胀，腮有出血。 2.4.2 回接感染 将患病鱼体的组织提取液回接入正常鱼体之后，三天过后就开始出现患病鱼 体的表型特征，就可以看见腹部有点状出血点出现，四天左右鱼开始死亡，五天 后所有鱼全部死亡。将死亡的鱼进行解剖，观察到死亡的鱼体内脏和患病鱼体内 脏出现相同的症状。在回接感染时，总共感染30尾鲫，5天过后30尾鱼全部死亡， 死亡率高达100%。 2.4.3 分子生物学检测 将鱼体解剖取出患病鱼体的肾脏，提取出肾脏中DNA和RNA，通过已知的鲫 疱疹病毒解旋酶基因（鲫疱疹病毒解旋酶基因是鲫疱疹病毒基因组中保守序列28） ，设计上下游引物，然后通过PCR和RT-PCR技术对鱼疱疹病毒解旋酶基因进行特 异性扩增（结果见图2-2） 。得到了一条约362bp特异性的扩增片段，表明在患病的 鱼体基因组和转录组中都存在鱼疱疹病解旋酶基因。同时也证实了利用PCR和 RT-PCR技术来检测鲫出血病是可行的。 12 图2-2 分子生物学检测 Fig. 2-2 Detection of molecular biology (A) 肾脏组织中提取的DNA电泳图； (B) 鱼疱疹病毒基因的PCR扩增；(C) 肾脏组织中提取的RNA电泳图； (D) 鱼疱疹病毒基因的RT-PCR扩增 参 考 文 献 1 冯东岳, 温周瑞. 鱼类病毒病的研究进展及其展望J. 水产养殖, 2011(6): 18- 21. 2 张奇亚, 肖枫, 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