基因的转移技术.ppt

第六章 基因的转移技术,第一节 基因的导入方法,所谓基因的转移技术就是将外源目的基因或DNA片段引人受体生物或细胞并检查其在转化细胞中表达结果的一种技术。 一基因导入方法 1细胞融合 10-6 2微细胞介导的基因转移 小于或等于10-6 3染色体介导的基因转移 10-6利用中期染色体DNA进行转移 4脂质体介导的基因转移 约210-4先用脂质体包装DNA，然后与 细菌，植物原生质体融合 5磷酸钙沉淀介导基因转移 10-310-7 6原生质体融合术 约0.10.3%溶菌酶处理细菌，再与动物细胞，植物原生质体融合,7显微注射法 约110%直接注射入细胞质或细胞核内 显微注射法利用显微操纵器，将DNA直接注射到细胞核中 穿刺法利用注射显微镜将微注射针固定，然后穿刺将DNA注入细胞核内,8电脉冲介导的基因转移 10-4利用电脉冲改变生物膜透性，DNA可直接进入各种细胞 9重组RNA病毒感染 约10100%适用于动植物细胞 10重组DNA病毒感染 约100%适用于各种细胞 11直接转化法 包括：完整细胞或原生质体与DNA直接接触，DNA进入细胞内，这种方法适用于细菌，酵母菌，真菌和植物细胞。,12接合转移法 适用于细菌之间和细菌与植物细胞之间，这种DNA转移是借助于某些质粒上的转移基因产物 13超声波法 现已用于植物细胞，可能还可用于其它生物 14. 基因枪法,二转移方法的选择 选择方法的依据： 1转化频率 取决于以下几个因素： 1) 外源DNA能否易于进入宿主细胞； 2) 重组DNA分子能否自主复制 3) 标记基因表达效率 2.检测转化体的方法：是否具有选择压力 3.生物材料的种类：细胞大小，有无细胞壁，除去细胞壁后的原生质体能否易于再生 4.已有实验条件：仪器，载体种类等,第二节 转化体的检测,1. 药物抗性检测 如用于细菌, 真菌, 植物和动物细胞的各种抗生素抗性基因: Ampr, Kanr, Hygr, G418r, Tcr等 2. 遗传互补检测 如用于酵母菌的各种氨基酸, 核苷酸合成酶基因: LEU2, TRP1, TRP3, URA3等 3. 表型选择 如用于细菌, 植物和动物的LacZ, GUS等基因; 用于细菌的噬菌斑 4. 凝胶电泳 对于自主复制型载体, 可从转化子中提取质粒DNA, 然后经过电泳法进一步证实 5. Southern杂交 对于整合型载体, 则应该利用DNA杂交法证实,第七章 基 因 表 达,第一节 研究基因表达的方法,研究基因表达应从以下几个方面考虑： 1）转录：起始，延长和终止。基因转录的调控主要是起始阶段 2）转录后修饰：hnRNA 的加帽，加尾，拼接 3）翻译：起始，延长和终止。调控亦是在起始阶段 4）翻译后修饰：蛋白质的糖基化，蛋白质水解反应，蛋白质的分泌等。 一转录系统 1. 体外转录系统 1）分离RNA聚合酶，然后在体外进行待测DNA的转录反应 2）利用全细胞抽提液，加入外源DNA，目前使用最广泛的抽提液来自海拉细胞和KB细胞 3）利用具有SP6, T3和T7启动子的载体转录插入的外源DNA,2. 体内转录系统 先分离细胞核，再进行转录反应 二翻译系统 体外翻译系统（In vitro translation system）又称之为体外蛋白质合成系统(in vitro protein synthesis system)，是一种细胞裂解物，这种系统只有翻译功能，当加入外源mRNA，能量物质和氨基酸，该系统就能合成蛋白质，经SDSPAGE后可检测出翻译活性。 常用翻译系统有以下几种： 1. 兔网织细胞裂解物(reticylocyte lysate system) 由未成熟的兔红细胞裂解而成，该种细胞是向动物注射苯肼后引起贫血产生的,向该系统加入血红素基和能量物质，裂解物中的内源mRNA可被翻译成球蛋白 ，其合成速度与用完整细胞的合成速度接近。,2. 小麦胚抽提物(wheat germ extract) 该系统不具内源mRNA，属外源mRNA 依赖型，利用Sephadex-G50可减少该系统中的内源氨基酸，因而可大大增加翻译产物的高比活性。 由于该系统存在着核酸酶和蛋白酶，因此不能用于翻译很大的mRNA ，该系统仅为前一系统活性的1/10。 3. 其它系统： 鼠骨髓瘤抽提物，艾氏腹水瘤和酿酒酵母裂解物等。 4. 两栖动物卵母细胞: 翻译效率高，翻译产物稳定，灵敏度高（10ng mRNA ），也可作为转录翻译系统。,微球菌核酸酶可除去内源mRNA，同时也不会对系统中的tRNA和rRNA 损伤过大。由于该核酸酶的活性依赖于Ca2+，当除去内源mRNA后，可用EGTA除去Ca2+，此系统仍可保持70%的活性。 因该系统无内源核酸酶和蛋白酶，可用于大分子mRNA 的翻译。,三转录翻译系统 1. 原核生物系统 1) 体内基因表达系统 i. UV照射宿主系统(U.V.irradiated host system) E.coli经大量紫外线照射后，宿主细胞合成大大减少，然后感染携带外源基因的重组分子，并同时加入带标记氨基酸。新合成的蛋白质用SDSPAGE检查。大多数的蛋白质合成可用宿主已有的溶源化或携带的质粒（含有CI基因）抑制。 ii. 小细胞系统(minicell system) E.coli 突变株（min A，min B）可形成大量无核小细胞，但细胞中的质粒DNA可进入小细胞，当纯化的小细胞与带标记的氨基酸共培养，质粒上携带的外源基因便可获得表达，产物用SDSPAGE检查。,iii.大细胞系统(maxicell system) 对紫外光敏感的E.coli突变株经低剂量紫外光照射后，损伤的DNA会被大量降解，由于质粒DNA分子量小，可继续存活。加入标记氨基酸后，质粒上的外源基因可获带标记产物，用SDSPAGE分析。 2) 体外基因表达系 E.coli无细胞粗提液，加入外源DNA和必须因子后可得表达产物。 2. 真核生物系统 1) 哺乳动物细胞 2) 两栖动物卵母细胞,第二节 外源基因的表达,一. 当外源基因引入某宿主细胞表达时，应考虑以下各种因素： 1. 外源基因的启动子顺序能否在宿主细胞起作用（利用表达载体） 2. 对转录产物能否进行加工修饰（利用cDNA） 3. 转录产物的稳定性 4. 转录产物的核糖体识别顺序能否为宿主细胞的翻译系统所识别（利用表达载体的基因融合技术） 5. 密码子的使用频率（选用适当宿主细胞） 6. 翻译产物的后修饰 选用适当宿主细胞,7. 翻译产物的稳定性 8. 外源基因产物对宿主是否有害 9. 外源基因产物产量（选用不同拷贝数的载体） 10. 外源基因的最终产物是否具有生物活性（选用适当宿主细胞） 11. 外源基因的稳定性（改变宿主细胞遗传特性，如将外源基因插入染色体） 12. 对于制备大量外源基因产物，还须考虑到表达产物与其它细胞成分的分离方法,二. 表达系统 1. 大肠杆菌系统: 融合表达和直接表达 小于80AAs的多肽可用融合表达系统, 分子量在100-300AAs 且无过多半胱氨酸的多肽可用直接表达 pET(plasmid for expression by T7 RNA polymerase), pTrcHis系列载体 2. 酵母表达系统: 酿酒酵母和巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)系统 直接表达和分泌表达 3. 昆虫杆状病毒表达系统 直接表达和分泌表达,4. 哺乳动物细胞表达系统 瞬时表达和稳定表达: 非微生物来源的大于500AAs的分泌蛋白质和表面受体蛋白,第八章 基 因 突 变,第一节 基因的体外定向突变,一.缺失突变 1. 限制酶片段缺失,2. 限制酶位点缺失,DNA的单向缺失还可以利用两末端不同结构: (1) 5-和3-突起端;(2)第一种限制酶切, 脱磷酸化或-磷酸硫代物dNTP补齐末端,第二种限制酶切,然后外切酶或ExoIII作用.,3. 低聚核苷酸定向缺失,先人工合成一段低聚核苷酸,使其中一些已知核苷酸缺失,然后使之与相应ss-DNA退火,用DNA聚合酶合成另一条链,转化大肠杆菌,分离缺失体,低聚核苷酸缺失,低聚核苷酸插入,二. 插入突变 在已知的位点处插入一段DNA,其方法与缺失突变体十分相似,只是反其道行之,三. 点突变 1. 区域随机突变,2. 低聚核苷酸定向突变,3. 人工接头扫描法 1)利用ExoIII/S1从DNA两端进行顺序缺失,获一系列5-和3-端缺失体 2)从两个系列的缺失体中选出适当配对的缺失体,使两者连接起来以后相差10个核苷酸. 3)将上述配对的突变体用含10个核苷酸的人工接头连接起来. *人工接头的插入并未改变原来DNA片段的核苷酸数目.如果出现表型的变化则是由人工接头的核苷酸改变(即点突变)造成的. 4. 易错PCR方法 5. DNA片段洗牌技术,第二节 基 因 置 换,体外突变的基因引入原生质体内,检查不同的突变对表型有何影响,因此就需要用突变基因将野生型基因置换出来(原理见“载体“一章). 筛选方法: 突变基因DNA分子(leu2, URA3) 转化S.cerevisia(Ura-) Ura+转化体 选择Ura-重组体 影印筛选leu-突变体 核酸杂交 (pBR322探针),第九章 信息技术 在基因工程中的应用,第一节 计算机技术 在基因工程中的应用,DNA序列的收集、整理和分析：碱基比例、限制酶图、保守序列分析（调控序列、启动子序列、终止子序列等）、编码区序列和多肽序列（氨基酸序列、分子量、同源序列分析、糖基化位点、抗原决定序列、分泌信号肽序列和高级结构分析等） 基因组序列分析 SNP序列分析 PCR引物设计、DNA杂交探针设计 载体图形绘制,第二节 网络技术 在基因工程中的应用,一. DNA序列的查询、收集、整理和分析 1已测定的基因序列：按基因的种类查询或物种种类查询 2基因序列的登录 3同源性分析 二. 已发表论文查询 三. 方法学查询,四. Internet网的使用方法 1. 常用的查询网点:, EMBL http:/www.dna.affrc.go.jp DNA information and stock center(DISK) National center for biological information http:/www.ebi.ac.uk EMBL-European Bioinformation Institute BioMedNet The Institute for Genomic Research (TIGR) Nature Proceeding of National academic science Scienc