PCR、RT-PCR常见问题分析.ppt

PCR常见问题分析及解决方案,重庆升博生物科技有限公司 SHENGBO BIOTECH CO., LTD.,反应体系对PCR扩增的影响,DNA模板 纯度 蛋白、多糖、酚类等抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓度 浓度适当,引物 设计 长度适当、避免二级结构和二聚体 合成质量 浓度 50uL体系引物加量为10-20 pmol,反应体系对PCR扩增的影响,反应Buffer pH、盐离子、稳定剂、增强剂 提供缓冲环境 Mg 2浓度 过高非特异性严重 过低无扩增产物 dNTP Mixture 浓度适当，避免反复冻融 ddH2O pH值适当，避免污染,反应Buffer pH、盐离子、稳定剂、增强剂 提供缓冲环境 Mg 2浓度 过高非特异性严重 过低无扩增产物 dNTP Mixture 浓度适当，避免反复冻融 ddH2O pH值适当，避免污染,反应Buffer pH、盐离子、稳定剂、增强剂 提供缓冲环境 Mg 2浓度 过高非特异性严重 过低无扩增产物 dNTP Mixture 浓度适当，避免反复冻融 ddH2O pH值适当，避免污染,如何选择最合适的DNA聚合酶,PCR用耐热DNA聚合酶 （ PCR 实验的不同需求）,4 混合酶,4 混合酶高扩增效率高保真度,Taq plus Taq+pfu 用于复杂模板（GC rich, 二级结构）扩增 大多数情况下可替代Taq, 特别是产物在6Kb以上时，可扩10-20kb。 Long Taq Taq+pfu 超长片断扩增，15-40kb. Taq platinum HotStart+pfu 高扩增效率高保真度,预配的PCR反应液 DNA聚合酶 反应缓冲液 dNTP PCR增强剂,PCR MasterMix,PCR常见问题分析,PCR常见问题,无扩增产物 非特异性扩增或拖尾 假阳性,问题1：无扩增产物,现象：正对照有条带，而样品则无,M,样品A,样品B,正对照,纯度：含有抑制物 浓度：含量低 质量：全长 结构：二级结构,原因,对 策,纯化模板或者使用优质试剂盒提取模板DNA 加大模板的用量 用好的反转录酶 用温度高的反转录酶,无扩增产物之模板原因,引物错误 引物设计不好 引物降解 引物合成、纯化不好,原因,对 策,合成前检查 评价、重新设计引物 换一管新引物 免费重新合成,无扩增产物之引物原因,退火温度 延伸时间 循环次数,原因,对 策,递度PCR 聚合酶的延伸速度 适当增加循环数,无扩增产物之PCR条件原因,现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带,问题2：非特异性扩增,M 1 2,非特异性扩增,提高PCR特异性的策略,巢式PCR（Nest-PCR） 递减PCR（TouchDown PCR） 热启动PCR（HotStart PCR） 使用PCR增强剂,四种策略,前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。 循环设在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2,直到退火温度低于Tm 5。,特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。,递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。,策略之二 递减PCR（TouchDown PCR）,热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度 通常选择热启动Taq酶 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一,策略之三 热启动PCR,甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等 可能的机理：降低熔解温度，有助于引物退火，辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区 增强剂浓度要适当,策略之四 使用PCR增强剂,RT-PCR简介,主要内容,RT-PCR原理 RT-PCR步骤 常见问题分析,一步法RT-PCR,两步法与一步法RT-PCR比较,分析基因的转录水平 获取目的基因 合成cDNA探针,RT-PCR主要用途,逆转录酶的选择,AMV： 禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和RNA酶H活性。最适42，最新版本可达60 （Bioflux公司）。 MMLV： Moloney 鼠白血病病毒，逆转录酶，RNA酶H活性较弱。最适37，最新版本42 （赛百盛） Super RNaseH- Reverse Transcriptase MMLV反转录酶的RNase H-突变体，它能将更大部分的RNA转换成cDNA，最适42。（Tiangen天根生化）,RNase H的作用,水解RNA-DNA杂合链中的RNA Super RNaseH- Reverse Transcriptase,MMLV反转录酶的RNase H-突变体 逆转录效率高,提高RT-PCR特异性,提高逆转录酶保温温度 减少基因组DNA污染,RT常见问题,RNA降解或起始量少 RNA含抑制成分 cDNA 5端不全 目的基因在组织中不 表达或表达量太低,原因,对 策,分离高质量的RNA 使用高温逆转录酶，如RT007（BioFlux） 使用随机引物或GSP 尝试其它组织,问题1：RT-PCR没有产物,六种Taq和MasterMix： Taq、Pfu、HotStart Taq、Taq plus、Long Taq、Taq Platinum dNTP 引物 SP6,Tn7,M13,Super RNase H- Reverse Transcriptase,TA 克隆系统： pBS-T 载体、连接和克隆试剂盒 pGM-T 载体、连接和克隆试剂盒 pCF-T 、pCF-Blunt 载体、快速连接试剂盒 感受态细胞,DNA Marker：22种不同大小的分子量标准,TIANGEN相关产品,PCR引物设计,引物的重要性,引物设计是PCR成功的关键。 PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。 引物设计需要一定的经验，不能单纯依赖软件。,引物设计一般原则：长度,引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp，但长片段扩增时，引物长度30-35 bp。 引物过短易引起错配现象。 例：一个12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点，而20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个. 较长的引物（28-35bp)，还常用来区分同源性较高的模板序列或者用于产生一些突变位点。,引物设计一般原则：结构,尽量避免引物序列形成发夹，特别是3端。 尽量避免引物间形成二聚体、特别是3端前3个碱基间不能有二聚体。 避开局部富含GC或AT，3端避开连续同样的碱基，如GGG，CCC和AT rich.,引物设计一般原则：错配,尽量避免引物在模板上有错配位点 3端尤其不要形成非特异性结合。 无法避免错配时，最好不要有产物生成。 引物3端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。,引物设计一般原则: GC含量,引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。 上下游引物的GC含量不能相差太大。 不同的算法推荐45-55%或50-60%,引物设计软件,Primer Premier5.0 （自动搜索）* Oligo6 （引物评价） Vector NTI Suit DNAsis Omiga DNAstar Primer3 （在线服务）,Primer premier5.0使用简介,主要功能: 1、引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA基元(motif)查找 4、同源性分析,Primer premier5.0使用简介,引物设计最常用软件 引物序列自动搜索功能最强大 简单易用 可用于设计简并引物,Primer premier5.0使用简介,Primer Premier5.0下载、安装。 主页之下载中心 Primer Premier5.0使用演示,Primer premier5.0使用简介,Primer Premier5.0使用步聚： 粘贴序列: 复制序列FileNewDNA SequenceCtrl+V, 选AS is PrimerSerch设置引物参数OK 搜索完成再点OK，选择合要求的引物序列。 Blast检查引物特异性，必要时重新设计。,Primer premier5.0使用简介,Primer Premier5.0评价引物方法 粘贴序列: 复制序列FileNewDNA SequenceCtrl+V, 选AS is PrimerSEdit Primer Ctrl+VAnalyzePrimerOK PrimerAEdit Primer Ctrl+VAnalyzePrimerOK,免费引物设计服务,升博