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2 4 2国外医学卫生学分册2 0 0 3 年第3 0卷第4期 k a m a t a n i n , e t a l . j 1 . r rt h r i t i s r h e u m , 2 0 0 0 ， 4 3 ( 4 ) : 9 2 5 - 9 2 9 . 刘胜学. j 1 . 国外医学卫生学分册， 2 0 0 0 , h a y a s h i h， 7 7 9 - 7 8 4. 洪鸣鸣. j l e t a l . j .e n d o c r j , 1 9 9 8 , 4 5 : 中国心理卫生杂志，2 0 0 0 , 1 4 ，j，j 1， 门j，j r.ilr.l ，j工.j 000 ，2 rijrl 3 3 - 3 4. 3 0 1 摘要 : 2 7 ( 1 ) : 5 1 - 5 6 ，( 1 ) : z u o m ， e t a l . j j h u m g e n e t , 2 0 0 0 , 4 5 : 3 3 李 ( 1 ) : 5 8 - j l . 南京医科大学学报， 1 9 9 9 , 1 9 5 9 生物组织总氧自由基清除能力的检测方法及应用 徐玫， 朱心强 ( 浙江大学医学院毒理学研究室， 浙江杭州3 1 0 0 0 6 ) 目前常用的自由墓检测方法， 一类是通过建立氧自由墓产生休系， 采用理化方法直接或间接检测氧自 由基的变化， 这些方法只能对某种或某几种氧自由基分步进行检测， 测定结果重现性很低; 另一类是分析机体 某种抗氧化成分或自由基代谢产物的变化， 但其结果难以准确地反映生物体实际抗氧化应激的能力。本文简 要叙述了一种近年来出现的直接检测分子或组织对氧自由荃清除或吸收能力的方法， 并讨论了其应用前景 及发展趋势。 关键词: 总氧自由葵清除能力; 气相色谱 中图分类号: r - 3 3 1文献标识码: a文章编号: 1 0 0 1 - 1 2 2 6 ( 2 0 0 3 ) 0 4 - 0 2 4 2 - 0 4 随着自由基学说和生物医学的发展， 自 由基与疾病的关系受到了广泛的重视。许多 资料表明自由基参与一些疾病的病理过程， 它们能够氧化脂类、 蛋白质、 酶, d n a等生物 大分子， 导致生物膜损伤、 蛋白质变性、 酶失 活和d n a复制错误 ， 引起如肿瘤、 炎症、 免 疫性损伤、 氧中毒、 休克和心脑缺血一 再灌注 损伤等疾病和机体的过早衰老【 。生物体内 的自由基主要指活性氧， 它们是氧的某些中 间代谢产物或含氧的衍生物， 具有比氧更强 的氧化能力。在生理条件下， 活性氧处于一 种不断产生和不断清除的动态平衡状态， 这 是因为在人体内和食物中有几百种物质具有 抗氧化作用3 .4 1 ， 因而活性氧浓度是很低的， 不仅不会损伤机体， 而且可显示其独特的生 理作用。例如， 参与吞噬细胞杀灭侵人机体 的有害微生物， 参与前列腺素、 凝血酶原与胶 原蛋白的生物合成等。 收稿日期: 2 0 0 2 - 1 0 - 2 9 ; 修回日期: 2 0 0 3 - 0 3 - 0 3 作者简介: 徐玫( 1 9 8 0 - ) ， 女， 在读硕士， 研究方向: 生殖毒理。 1 目前常用的自由基检测方法及其不足 由于组织和细胞中的自由基浓度很低， 存在时间极短， 因此不易直接检测。随着分 子生物学的迅速发展， 研究短寿命自由基的 方法有所突破， 但仍不能彻底解决检测技术 的问题。目 前大多是通过建立氧自由基产生 体系， 如 f e n t o n 反应、 h z 0 2 和核黄素/ e d t a 光照体系、 黄00吟/ 黄嘿吟氧化酶体系、 组织 缺血再灌注模型等， 将样品或其提取物加人 各体系中， 采用电子自旋共振( e 5 r ) 技术、 自 旋捕集技术、 超微弱化学发光技术、 分光光度 法等直接或间接检测氧自由基的变化。这些 方法有两个共同的缺点: ( 1 ) 只能对某种氧自 由 基或者某几种氧自由基分步进行检测s ( 2 ) 由于自由基具有很高的反应活性， 在体系 中存在的时间极其短暂， 给检测带来很多困 难， 使测定结果重现性很低。此外， 有的方法 需要的仪器设备十分昂贵， 有的方法灵敏度、 国外医学卫生学分册2 0 0 3 年第3 0 卷第4 期 2 4 3 专一性还有待进一步提高。还有一类现在普 遍使用的检测方法是分析机体某种抗氧化成 分或自由基代谢产物的变化， 如 l p o , s o d , g s h - p x , c a t , m d a , v , , v , , 日 一 胡萝卜 素、 尿酸 等， 用这些指标来反映活性氧导致的毒性， 其 不足之处是难以准确地反映生物体实际抗氧 化应激的能力， 因为单一成分的变化尚不能 完全说明氧化损伤是否已经发生及其严重程 度。 2 总氧自由基清除能力检测方法 2 . 1 简介 总氧自由基清除能力( t o t a l o x y r a d i c a l s c a v e n g i n g c a p a c i t y , t o s c ) 检测法是近年来出 现的直接检测分子或组织对氧自由基的清除 或吸收能力的方法之一。该法起初是用来描 述热解 2 , 2 一 偶氮双( 2 - 眯基丙烷) 二盐酸盐 ( a b a p ) 和4 一 甲硫基一 2 一 丁酮酸钠盐( k m b a ) 产 生的超氧阴离子自由基的， 在反应中k m b a 最终氧化生成乙烯气体， 通过气相色谱法分 析反应瓶顶空的气体， 可对某分子或某生物 组织的抗氧化能力进行定量测定。现在 t o - s c 检测法可以用来检测不同的氧自由基生 成体系产生的不同的氧自由基， 如除了超氧 阴离子自由基之外的经基 自由基、 过氧亚硝 基等， 当生物组织抗氧化成分存在时可与 k m b a 竞争结合氧自由基而使乙烯的产量减 少， 根据乙烯产量的减少程度可以计算出所 测定样品的 t o s c值， 将此值校正为每克蛋 白质中具有的t o s c值， 能够在不同的样品 之间进行比较和评价。 2 . 2 实验方法 6 ,7 在 3 5 c , 1 0 0 m m o l / l磷酸钾缓 冲液 ( p h 7 . 4 ) 中热解2 0 m m o l / l a b a p ， 可以生成超 氧阴离子， 再与0 . 2 m m o l / l k m b a反应， 即产 生乙烯气体。f e n t o n 反应可以生成经基自由 基， 过氧亚硝基可以在 3 5 下 0 . 2 m m o l / l k m b a , 1 0 0 m m o l / l 磷酸钾缓冲液( p h 7 . 4 ) 和 0 . 1 m m o l / l五乙酸三钠钙( p e n t e t a t e c a l c iu m t r i s o d i u m , d t p a ) 反应中产生。 气相色谱分析采用s u p e l c o s p b - 1 色谱柱 ( 3 0 m x 0 . 3 2 m m o l / l x 0 . 2 5 m m o l / l ) 和火焰离 子化检测器( f i d ) 。柱箱、 进样器和检测器的 温度分别为3 5 c c , 1 6 0 和2 2 0 c c 。载气( n z ) 流速为 1 m l / m i n ， 分离比例为2 0 1 0 t o s c 值的计算公式是: t o s c 二1 0 0 一 s a / c a x 1 0 0 ， 其中s a和c a分别表示样品瓶和 控制瓶的色谱峰面积。t o s c为 0表示样品 没有清除能力( 即乙烯的产生没有被抑制， s a / c a二 1 ) ; t o s c的理论最大值为 1 0 0 ， 它意 味着乙烯的形成被完全抑制( 即s a / c a = 0 ) . 在离子一 抗坏血酸体系中当抗坏血酸与 离子的比例为5 : ( 7 5 -1 0 0 ) 之间时， 经基自由 基的产生率增加， 而且在5 : ( 7 5 一 1 0 0 ) 之间反 应最稳定。f e 与 e d t a的比例为 1 : 2 时， 最适合所有离子鳌合作用， f e : e d t a : 抗坏 血酸为 1 : 2 : 1 0 0时， 改变 k m b a氧化物离子 浓度所得的效应， 可以与经基自由基产生体 系( 2 0 m m o l / l a b a p , 0 . 2 m m o l / l k m b a ) 所得 的相比 较。在过氧亚硝基产生体系( s y d n o n i - m i n e ， s i c - 1 ) 中， 1 . 8 m m o l / l f e + , 3 . 6 m m o l / l e d t a和1 8 0 m m o l / l抗坏血酸( 经基自由基 产生体系) ， 或8 0 n .m o l s i n - 1 与0 . 2 m m o l/ l k m b a反应， 可以与 a b a p所产生的结果相 l 匕 。 t o s c 分析法的主要优点是对检测水溶 性和脂溶性物质的自由基清除能力都十分有 效， 它还能区分快速作用的抗氧化剂和缓冲 剂 s ， 评价生物组织的抗氧化能力 9 . 10 。而 检测氧化作用的典型方法， 虽然对于理解各 种氧化剂与抗氧化剂之间的关系十分有用， 但难以在定量水平上评价生物实际抗氧化应 激的能力。 由于生物组织对不同氧化物的清除能力 各不相同， 有学者将 t o s c检测法的检测对 象进行了 相应的扩大， 使该方法能够针对不 同的氧化剂作出不同的检测与评价。利用3 种不同的氧化剂生成体系可以产生过氧亚硝 基、 超氧阴离子自由基和经基自由基， 保持氧 化底物k m b a 在各体系中的浓度不变， 使得 2 4 4国外医学卫生学分册2 0 0 3 年第3 0 卷第4 期 每种氧化剂在整个反应过程中引起等量的乙 烯生成。这样， 各种抗氧化剂对不同氧化剂 的作用能力之间比较才相对有效。 2 . 3 讨论 由于机体或抗氧化剂抑制不同氧化物的 效率不同， 所以评价机体或抗氧化剂在生物 系统真正的抗氧化能力是很困难的。因此， 将抗氧化作用的测量推广到更广的氧化物范 围， 有助于更好的理解在不同条件下组织对 氧化刺激的抵抗力或者易感性。目前， 已有 人用t o s c 方法评价海洋无脊椎动物组织对 超氧阴离子自由基的清除能力 9 . 10 ) ， 并且推 广此方法用于评价北极、 南极、 地中海贝类对 s i n - 1 体系和离子一 抗坏血酸体系产生的氧化 物的清除能力。 不同的抗氧化剂与不同氧化物和 k m b a 反应具有相对能力， 这种相对能力， 不仅可以 用来评价它们作为清除剂的相对效率， 而且 也可以评价不同氧化物的化学活性。s i n - 1 降解可以产生亚硝基氮， 还可以在磷酸盐缓 冲液( p h 7 . 4 , 3 7 t) 中产生超氧阴离子o z 和n o ， 其产生率分别是 7 . 0 2和 3 . 6 8 m m o l / ( l “ m in ) “ 、 超氧 化物和n o 的 反 应扩展限 度相近 12 ， 因此， s i n - 1 同任何一个能同时产 生这些氧化物的体系一样， 能潜在的产生亚 硝基氮 ” ” 一 6 ) 。在生理p h值情况下， 亚硝 基氮的降解非常迅速， 半减期短于一秒 17 1 并形成其他的强氧化物。目前， 经自由基是 确定产生氧化物底物的常用指标 ” ， ” 一 川。 因此， 这些氧化物的确切本质还不清楚。 . k m b a不是直接被 o z 或者 n o氧化生 成乙烯， 因为 k m b a和 n o释放的一个化合 物n o c - 7 反应没有生成乙烯。因此， 以s i n - 1 体系为煤介的k m b a氧化物依赖于超氧化物 和n o反应产生一个更强的氧化物。s o d的 作用就是有力的证据， s o d通过s i n - 1 ， 而不 是通过离子一 抗坏血酸或 a b a p抑制乙烯生 成， 因为后两者都与 o z 产生的最终氧化物 有关。从以 s i n - 1为媒介的 k m b a氧化物 中， 发现 s o d的部分抑制效应与 n o和 s o d 对超氧化物的有效竞争有关。口， 和 n o持 续的反应率估计在 1 x 1 0 8 和6 . 7 x 1 0 9 m - s - 之间， 此值与超氧化物歧化酶催化的反应 率相似或更高( k s o 。 二 2 x 1 0 9 m 一 s - ) a 运用t o s c 检测分析法发现一些特异的 g s h 、 尿酸和t r o l o x 保护模式， 防止被研究过 程中 产生的氧化物k m b a氧化 ， ， 。g s h 、 尿 酸和t r o l o x 与离子一 抗坏血酸和s i n - 1 产生的 氧化物作用也有很明显的区别。g s h是唯一 能区别a b a p 和s i n - 1 体系产生氧化物的物 质。从量上看， 抑制 s i n - 1 产生的氧化物比 a b a p 产生的氧化物需要更多的 g s h 。用 t o s c 检测分析法的结果还表明， 不同氧化物 产生体系通过反应过程产生相等量乙烯的标 准， 这对定量比较抗氧化剂对不同氧化物的 清除效率来说， 是一种很好的 应用2 2 1 0 目 前已建立的t o s c 检测分析方法具有 快速、 灵敏、 高分辨的优点， 通过乙烯制备体 系的转换， 考虑到所有能与氧自由基反应的 物质所发挥的作用， 克服了测定单一抗氧化 成分方法的不足， 反映了体系总的抗氧化能 力。t o s c 作为一项生物标志物， 具有广泛的 应用前景与价值， 对于各种外源性化合物对 机体氧化损伤的评价、 新型抗氧化剂的筛选 等研究都可以尝试运用此方法。 参考文献 : c ro s s c e , e t a l . j 7 、 a n n i n t e rn m e d , 1 9 8 7 ， 1 0 7 :5 2 6 - 5 3 0. m a r x j l . 金时俊. 用 m ) . h a l l i w e l l 1 9 9 9 , 1 : 许申鸿. wi n s t o n m e d i c i n e j 7 . s c i e n c e , 1 9 8 7 ， 食品添加剂一 现状 2 3 5 :5 2 9 - 5 3 9 . 生产、 性能、 应 ，曰lesj，j ，.2， rlrraj尸l 上海: 华东华工学院出版社， 1 9 9 2 . b . j . f o o d s c i a n d a g r i c h e m , 6 7 - 1 0 9. j 食品科学， 2 0 0 1 , 2 2 : 7 3 - 7 5 . g w, e t a l . j . f r e e r a d i c a l b i o l o g y ， 1 9 9 8 , 2 4 ( 3 ) : 4 8 0 - 4 9 3 . ，j飞.j，j 4116 r.lr尸l 7 w i n s t o n g w, e t a l . i n : r a g r e e n w a l d e d , c r c h a n d b o o k o f m e t h o d s f o r o x y g e n r a d i c a l b e - s e a r c h m . b o c a r a t o n c r c p re s s , 1 9 8 5 . 国外医学卫生学分册2 0 0 3 年第3 0 卷第4期 2 4 5 m e d , 1 9 9 8 , 2 4 : 5 2 2 - 5 2 8 . r a k e s h p p , e t a l . j . j b i o l c h e m , 1 9 9 1 ， 2 6 6: 4 2 2 4 - 4 2 5 0. b e c k m a n j s , e t a l j .p ro c n a i l a c a d s c i u s a , 1 9 9 0 , 8 7 : 1 6 2 0 - 1 6 2 4 . r a d i r , e t a l . j . j b i o l c h e m , 1 9 9 1 ， 2 6 6 : 4 2 4 4 - 4 2 5 0 r a d i r . j . m e th o d s e n z y m o l , 1 9 9 6 , 2 6 9 : 3 5 4 - 3 6 6. k o p p e n o l w h , e t a l . j . t o x ic o lo g y , 1 9 9 2 , 5 : 8 3 4 - 8 4 2 . g u t t e r id g e j m c , e t a l . j . b io c h e m j , 1 9 9 0 , 2 6 9 : 1 6 9 - 1 7 4 . r e g o l i f , e t a l . j . t o x ic o l a p p l p h a r m a c o l , 1 9 9 9 , 1 5 6 : 9 6 - 1 0 5 . 闷一一一.一一 67 j.且1. r.lr.il 飞ij工，esjesl 000产 尸tfj lsj网 p ry o r w a , e t a l . j . j o r g c h e m , 1 9 9 3 , 5 8 : 3 5 2 1 - 3 5 3 2 r e g o l i f , e t a l . j . m a r e n v ir o n r e s , 1 9 9 8 , 4 6: 4 3 9 - 4 4 2. r e g o l i f , e t a l . j . c h e m o s p h e r e , 1 9 9 8 , 3 7 : 1 4 - 1 5. h o g g n , e t a l . j . b io c h e m j , 1 9 9 2 , 2 8 1 : 4 1 9 - 4 2 4. h u i e r e , e t a l . j . f r e e r a d i c a l r e s , 1 9 9 3 ， 1 8 :1 9 5 - 1 9 9. f e e l i s h m , e t a l . j . j c a r d i o v a s c p h a r m a c o l , 1 9 8 9 , 1 4 ( s u p p l 1 1 ) : s 1 3 - s 1 2 . l ip to n s a , e t a l . j . n a t u r e , 1 9 9 3 ， 3 6 4 : 6 2 6 - 6 3 2 . l o m o n s o v a e e , e t a l . 1 . f r e e r a d i c a l b i o l 1.ij 01 .且月且 rwelr月j lesll.j 0l 22 一l工il ，月，j 2内j .二山.1 r.卫jrj 2 2 ，11飞.1 411 二. rjlj 孰 扁 若 嘛姆娜翻 疥 0 8 8 烃类可能影响月经周期 研究表明， 暴露于燃料和溶剂中的烃类可严重 影响男女生育力。 辛辛那提大学和国立职业安全与 卫生研究所的研究者深人研究了这一问题， 调查设 计了检测低剂量烃类暴露对女性内分泌的潜在影 响。分析表明， 低水