25株SIVHIV的进化分析及意义.pdf

文章编号：0427-7104 （2006） 03-0303-06 收稿日期：2006-02-14 作者简介：袁伟 （1981） ， 女， 硕士研究生； 通讯联系人黄青山副教授 . 25 株 siv/ hiv 的进化分析及意义 袁伟1， 吴宏宇2， 黄青山1， 2 （1.复旦大学 生命科学学院 遗传学研究所 遗传工程国家重点实验室， 上海200433； 2.上海高科联合生物技术研发有限公司， 上海201206） 摘要：选取了 16 株 siv 和 9 株 hiv 毒株， 以人 t 细胞白血病病毒 htlv-1 为 outgroup， 使用 clustal x、 phylip 及 mega 三种软件对它们的基因组序列及三个主要蛋白 （env， gag， pol） 序列分别进行了比对分析， 用 neighbor-joining（n-j） 方法和 maximum likelihood （ml） 方法分别构建出进化树 .结果显示 hiv 起源于 siv， 其中 hiv-1 的起源与 sivcpz 的几种亚型高度相关， hiv-2 的起源与 sivsm 及 sivmm 高度相关 . 关键词：siv；hiv；进化分析；neighbor-joining方法；maximum likelihood 方法 中图分类号：r 373文献标识码：a hiv 和 siv 均属于灵长类慢病毒（lentivirus） . hiv 主要分为 hiv-1 和 hiv-2， 还有一种 shiv （simian-human immunodeficiency virus） .每种亚型都 有很多毒株不断被发现， 到作者写稿时为止， 提交到 ncbi （http： / / www . ncbi. nlm. nih. gov） 的 hiv 相关 核苷酸序列有 2 037 条， 蛋白质序列有 615 条， 在 hiv 数据库中的序列就更多 . 其中， hiv-1 目前被分为 m、 n 和 o 三组， 每个组又有不同的亚型和流行重组模式 （crf） .这三个组代表了不同的种间交叉传递事 件 1.研究表明， 在传染给人之前， m 组和 o 组的 hiv-1 已经分别从祖先灵长类慢病毒中分离出来， 并且 传染给人的时间也较接近 2 4. siv 同样包括很多不同的毒株， ncbi 收录的 siv 核酸序列及蛋白质序列数量超过了 hiv， 分别为 5 887和7 634 （到写稿时为止） .目前， siv 分为 7 个亚型， 其中从弥猴 （macaque） 中分离出来的 sivmac 因 其性质更接近 hiv， 被较多的应用于 siv 感染猿猴模型的构建中 5. 据研究， hiv-1 可能起源于黑猩猩 （chimpanzee） 的 sivcpz 1， 而 hiv-2 可能起源于白领白眉猴 （sooty mangabey） 的 sivsm 6 11.siv 在天然宿主中是不引起类似人类艾滋病的症状的， 只有发生跨物种传播 时， 才能使新物种产生免疫缺陷症状 1. 由于 siv 和 hiv 在进化上的这种密切关系， 在 hiv 患者不断增加的今天， 利用 siv 感染猿猴模型 5 已经成为艾滋病实验性治疗研究的重要手段， 很多抗 hiv 药物研究也采用 siv 作为辅助研究工具， 因此， 阐明 siv 和 hiv 的分子进化关系成为一个非常重要且亟待解决的问题 . 了解这种进化关系， 对 siv 和 hiv 的传播方式、 siv 的研究成果在 hiv 治疗中的应用等方面均有重要意义 . 当前研究中， 多数作者 1 4， 6 17以获取并测定新的毒株序列出发， 用全长或者部份基因组以及结构 蛋白的一种 （或二、 三种） 序列，对数据库的相关序列作多序列比对， 再进行系统分析以阐明其在 hiv / siv 进化关系中的地位 .只有少数作者既对毒株的三个结构蛋白又对全长基因组作了进化分析，如 yam- aguchi j 等 2002 及 2003 年的两篇论文 18， 19 . jarbo c 等20在介绍 n-j 的原理及计算方法时用了 8 株 hiv / siv 的pol 基因， 但他们指出有必要对 env 及 gag再作比较分析， 最好以不同软件及方法作计算， 使 所得系统树更为可信 . ml 方法通常被认为准确性更强， 但由于费时较长目前还未被广泛使用 2， 3.本文对 25 株 hiv / siv 全长基因组序列及三个结构蛋白序列均进行了分析， 并采用了三种软件 （phylip， clustal x， mega） 同一种方法 （n-j） ， 同一软件 （phylip） 的两种方法 （n-j， ml） 做比较， 通过分析不 第 45 卷第 3 期 2006 年 6 月 复 旦 学 报（自然科学版） journal of fudan university（natural science） vol.45 no.3 jun. 2006 同软件不同方法所得进化树的分枝点的异同， 可以更全面更准确地分析 hiv、 siv 核酸及蛋白序列的进 化关系异同， 从而避免采用单一方法单一软件的片面性局限性 . 1方法 1.1选取序列 通过参考大量文献 7， 12 15， 18 19和数据库， 我们从 ncbi 网络上的相关数据库中选取了 16 株 siv 和 9 株 hiv 的全长基因组及三个主要蛋白 （env， gag， pol） 的序列； outgroup为人 t 细胞白血病病毒 htlv- 1， 与 hiv / siv 均属逆转录病毒科， 后者为慢病毒属， 前者为人 t 细胞白血病-牛白血病病毒属， 该序列被 用于 jarbo c 等 20的研究中作为 outgroup， 我们认为也适用于本研究 .在 26 条比对序列中： 全长基因组核 苷酸序列共 26 条； env 蛋白序列共 25 条， 缺少 siv mm251 的序列； gag蛋白序列共 24 条， 缺少 sivcpz 和 hiv d205 的序列； pol 蛋白序列共 19 条， 缺少 sivcpz cam5，sivcpz us， （civ）（siv （cpz） ） ，siv 677 gri-1，hiv d205， sivsmm 和 hiv bru 的序列 .序列详细信息见表 1. 表 1 序列信息 tab.1 seq uences information 序号isolate 核酸序列 gb 号 核苷 酸数 gag 蛋白序 列 gb 号 氨基 酸数 pol 蛋白序 列 gb 号 氨基 酸数 env 蛋白序 列 gb 号 氨基 酸数 1sivcpzaf115393.19170aaf18574.1507aaf18575.11 013aaf18578.1859 2sivcpz cam5aj271369.19261cab96408.1502c ab96414.1865 3sivcp z usaf103818.19788aad17910.1836 4sivcpz cam13ay169968.19284aar02350.1506aan182 71.21002aan18273.2864 5（civ）（siv （cpz） ） x52154.19811caa36401.1508caa36407.1854 6sivcpz gab2af382828.19354aam34553.1507aam3455 4.11010aam34560.1856 7sivcpz tan1af447763.19326aao13959.1524aao1396 0.1999aao13966.1871 8sivcpzantu42720.29068aab47723.1522aab47724.2 1014aab47730.2858 9shiv-89.6pu89134.19860aac57419.1510aac 57420.11 059aac57427.1869 10sivmon-99cmcml1ay340701.19448aar02376 .1510aar02377.11 017aar02382.1887 11sivmus-01cm1085ay340700.19 420aar02367 .1509aar02368.11 011aar02373.1897 12sivdenaj580407.19 679cae46398.1558cae4 6399.11 004cae46405.1864 13siv mm251m19499.110 277aab59905.1506aab 59906.11 056 14sivsmmx14307.110 241caa32483.1507caa32 487.1885 15siv gb1m27470.19 215aab49568.1502aab495 69.11 009aab49574.1821 16siv， isolate677m58410.19 623aaa47588.1513aaa4 7591.1854 17hiv d205x61240.110 269caa43572.1859 18hiv-2uc1l07625.110 271aaa43941.1521aaa 43942.11 061aaa43946.1857 19hiv-2 rodm15390.19 671aab00763.1522aab0 0764.1876aab00770.1858 20hiv-2 / stm31113.19 672aab01351.1521aab0 1352.11 059aab01358.1859 21hiv-1m27323.19 143aaa44868.1497aaa4486 9.11 002aaa44873.1846 22hiv elik034549 176aaa44324.1500aaa44325 .1912aaa44329.1853 23hiv bruk02013.19 229aab59747.1512aab597 51.1861 24hiv malx044159 229caa28011.1505caa28012 .1902caa28016.1859 25hiv-1 90cd121e12af457101.18 784aal51089 .1496aal51090.11 002aal51096.1845 26htlv-i， strain atkj02029.19 068aaa96672.1429aaa96673.1896aaa96674.1488 1.2序列比对 将表 1 所示各基因组核酸序列和三种蛋白质序列 （gag，pol，env） 的数据分别以 fasta 格式输入 clustal x （version 1.83） ，进行全长多序列比对， 保存后缀名为 aln，phy， dnd， ph， phb 格式的文件以作 下面的分析 .比对时软件设置为默认设置 . 1.3序列分析 （1）clustal x 分析用 clustal x 21程序进行进化分析， 进化树构建采用 neighbor-joining20 建树方法 .bootstrap tree 的设置为： random number generator seeder-111，number of bootstrap trails-1000. 其他设置为默认设置 . 403 复 旦 学 报 （自然科学版）第 45 卷 （2）phylip 分析将 clustal x 分析得 到 的序列比对数据 （. phy） 用 phylip version3. 63 （http ： / / evolution.genetics. / phylip.html） 软件包进行分析 . 进化树用两种方法构建， 一种 是 neighbor-joining（n-j） 法， 另一种是 maximum likelihood（ml） 法， 最后对上述两种方法构建的进化树 进行相互验证 .其他设置均为默认设置 . （3）mega 分析用 mega verson 3.1 （http： / / www . megasoftware. net / index. htm） 进行进化分析， 进化树构建采用 neighbor-joining（n-j） 建树方法，同时计算出进化距离， 设置均为默认值 . 2结果 2.1不同软件 n-j 法分析结果 n-j 法是一种基于距离的建树方法， 所谓距离法是指进化树的拓扑形状是由两两序列的进化距离决 定的， 进化树枝条的长度代表着进化距离 . n-j 法是一个经常被使用的算法， 它构建的进化树相对准确， 而 且计算快捷 .其缺点是序列上的所有位点都被同等对待， 而且所分析的序列的进化距离不能太大 .本文使 用 clustal x、 phylip 及 mega 三种软件对 25 株 siv / hiv 的基因组序列和三种蛋白序列分别进行 进化分析， 构建了 n-j 进化树 .目的是通过比较不同软件的 n-j 建树程序计算的结果来检验结果的可靠 性 . mega， clustal x 构建的 n-j 进化树与 phylip 构建的 n-j 进化树相似， 因篇幅所限， 本文仅列出 后者 . （1）全长基因组分析结果如图 1 （a）（见第 306 页） 所示， phylip 软件构建的进化树可分为较明显 的四组： sivcpz 组， siv 组， hiv-1 组和 sivsmm / hiv-2 组 .clustal x 和 mega 软件构建的进化树与 此类似， 但分枝点略有不同， outgroup与其他序列的进化距离明显较远， 和 siv 组的分枝点较近， 在这些软 件构建的非一致 n-j 树中可以很清楚的看到 outgroup与其他物种间存在很大的进化距离 . （2）蛋白质序列分析结果如图 1 （b d） 所示， 蛋白序列进化分析的结果基本与基因组序列进化分析 的结果一致， 不同软件的分析结果也是如此 . 差别主要出现在 env 蛋白进化分析的结果上， 如图 1 （b） 所 示， phylip 软件构建的进化树明显分出了三组， 分别为 sivcpz 组， hiv-1 组和 sivsmm / hiv-2 组， 而在 图 1 （a） 中较为明显的 siv 组在图 1 （b） 中变得不是很明显， 但是和其他的组还是有较为明显的区分 .唯一 有变化的是在图 1 （a） 中与 siv 组比较接近的 shiv-89.6p 被归入 hiv-1 组中， 而在图 1 （c， d） 对 gag和 pol 的进化分析中， shiv 89.6p 序列被归入 sivsmm / hiv-2 组， 具体来说应该是归入 sivsmm 组， 与基因 组进化分析中归为 siv 组比较接近 .env 蛋白进化分析中显示的特殊性揭示了 env 蛋白与其他蛋白相比 可能存在特殊性， 我们在讨论中将作相应阐述 . 2.2phylip 软件 ml 方法分析的结果 ml 方法是一种基于特征符的建树方法， 所谓特征符法是指进化树的拓扑形状是由序列上的每个碱 基 / 氨基酸的状态决定的 . ml 法通过把所有可能碱基或者氨基酸残基轮流置于进化树的内部节点上， 并 且计算每一个这样的序列产生实际数据的可能性， 所有可能性被加总就产生了一个特定位点的似然值， 然 后这个数据集的所有比对位点的似然值的乘积就是整个进化树的似然值 . ml 期望能够搜寻出一种进化 模型， 使得这个模型所能产生的数据与观察到的数据最相似 .因此 ml 法要进行大量的计算， 极为耗时 .本 文使用 phylip 软件对 siv / hiv 的基因组序列和三个主要蛋白序列构建 ml 进化树， 从不同的角度来 验证 n-j 进化分析结果的正确性 . 如图 2 所示， ml 方法构建的进化树与用 n-j 方法构建的进化树基本一致， 可分为较明显的四组， 即 sivcpz 组， siv 组， hiv-1 组和 sivsmm / hiv-2 组， 分枝点略有不同， outgroup与其他序列的进化距离明 显较远 . 3讨论 hiv-1 与 hiv-2 的起源问题一直倍受关注 . 关于 hiv-2 的起源， 大多数学者认为 hiv-2 起源于 sivsm.这与在西非发现的 hiv-2 与 sivsm （白领白眉猴病毒） 两者的基因组接近相吻合， 已为学者们所 公认 .本文的结果 （图 1、 图 2， 见第 306 页） 均显示几株 hiv-2 与 sivsm 及 sivmm （猕猴 siv） 在同一簇 503第 3 期袁伟等： 25 株 siv / hiv 的进化分析及意义 中 .有一种说法 1是 sivsm 传染给猕猴后演化为 sivmac， 当传给住在西非的人后则逐渐演变为 hiv-2. 关于人传给猴及猴猴相传的可能性、 其他灵长类传给猴及人的可能性均有待探索 . 图 1 siv 和 hiv 基因组和三个结构蛋白序进化树 fig.1phylopgenetic trees of siv / hiv genome sequences and three constructural protein sequences （a）为 siv 和 hiv 基因组序列 n-j tree； （b）为 siv 和 hiv env 蛋白序列 n-j tree； （c）为 siv 和 hiv gag蛋白序列 n-j tree； （d）为 siv 和 hiv pol 蛋白序列序列 n-j tree. （注： 图中所示树为 phylip软件包内的 seqboot （100 replicates） ， dnadist （基因组序列使用） 或者 prodist （蛋白序列使用） ，neighbor 和 consense 方法计算后构建， treeview 显示出的 n-j tree.） hiv-1 的起源远未定论 .它有 m， o， n 三个型， m 型分布最广； o 及 n 型 （或非 m 非 o 型） 集中在喀 麦隆 .至今为止， 认为 sivcpz 与 hiv-1 的关系最密切 .但是野生猴群受 sivcpz 的感染并不多； 加之该病毒 的亚群甚多 .比较一致的看法是， 在黑猩猩 （pan troglodytes troglodytes） 中分离得到的 sivcpz， 如 sivcpz us，sivcpz la，sivcpz cam3，三者的 vpu 基因与 hiv-1 （o， m 型） 的 vpu 接近 17但与处于东非的另一 种黑猩猩 pan troglodytes schweinfurthii（从扎伊尔进入比利时）分离得到的 sivcpz ant 相距较大 .后者 又与最东部的坦桑尼亚发现的 sivcpz tan1 相近 7. sivcpz ant 及 sivcpz tan1 似乎与 hiv-1 的进 化关系不是很近 . 本文结 果 显 示 5 株 hiv-1 附近的 sivcpz 簇包括 sivcpz、sivcpz us、sicvcpz gab2、sivcpz cam13、sivcpz cam5 及 （civ）（siv （cpz） ） 等六个株， 而 sivcpz tan1 及 sivcpz ant 则在 hiv-1 的另 一侧， 提示 sivcpz us 等与 hiv-1 的起源关系密切， 值得进一步从多方面探究 .一些散在的 siv 进化分 支， 也可加以关注， 继续积累资料 . siv 有不同的寄主， 其他灵长类动物在非洲的其他区域有无新的 siv， 对它们的分离鉴定、 核酸序列 测定及比较分析， 可能对人类慢病毒的起源有新的提示 .作者认为对数据库中人、 猿猴及其他灵长类动物 的线粒体 dna 全序列加以系统分析也可能对 hiv / siv 的起源提供有意义的信息（工作正在进行） . 603 复 旦 学 报 （自然科学版）第 45 卷 图 2 siv 和 hiv 基因组和三个结构蛋白序列进化树 fig.2phylogenetic tress of siv / hiv genome sequences and three constural protein sequences （a） 为 siv 和 hiv 基因组序列 ml tree； （b）为 siv 和 hiv env 蛋白序列 ml tree； （c）为 siv 和 hiv gag蛋白序列 ml tree； （d）为 siv 和 hiv pol 蛋白序列 ml tree. （注： ml 树通过 phylip软件包内的 seqboot （100 replicates） ， dnaml （基因组序列使用） 或者 proml （蛋白序列使用） 和 consense 方法计算后 drawtree 构建 .） 结果所显示 4 株 hiv-2 与 sivsm，sivmm 处于同一簇 （cluster） ， 与前人实验结果一致 .5 株 hiv-1 与 sivcpz us 等 6 株 sivcpz 靠近 .后者远离另一种黑猩猩上分离到的 sivcpz ant 与 sivcpz tan1，提 示不同寄主分离到的 sivcpz 与 hiv-1 的亲缘程度， 有助于重点选择 sivcpz 亚型， 深入研究 hiv-1 的起 源 . 结果还显示， shiv 89.6p 的基因组序列进化树及两个蛋白 （gag，pol） 序列进化树聚类相似， 都被归 入 siv 组， 但在 env 蛋白序列进化树上， shiv 89.6p 被归入 hiv-1 组， 我们推测可能是因为 env 蛋白跟 siv / hiv 的表面抗原高变性有很大关系， 所以进化速度可能快于其他蛋白及核酸序列， 可能跟人源的 hiv 关系更密切 .但是， 这一点还需要更多的实验数据及进化学的分析来验证 . 在本次研究中， 复旦大学罗祖玉教授给予了非常大的帮助及悉心指导， 特此感谢！ 参考文献： 1 gao f，bailes e，robertson d l，et al . origin of hiv-1 in the chimpanzee pan troglodytes troglodytesj . nature，1999，397 （6718） ：436-441. 2 loussert-ajaka i，chaix m l，korber b，et al . variability of human immunodeficiency virus type 1 group o strains isolated from cameroonian patients living in francej . j virol，1995，69 （9） ： 5640-5649. 3 bibollet-ruche f，loussert-ajaka i，simon f，et al . genetic characterization of accessory genes from human immunodeficiency virus type 1 group o strainsj . aids res and hum retroviruses，1998，14 （11） ：951- 703第 3 期袁伟等： 25 株 siv / hiv 的进化分析及意义 961. 4 janssens w，heyndrickx l，van der auwera g，et al . interpatient genetic variability of hiv-1 group oj . aids，1999，13 （1） ： 41-48. 5 lundgren b，bottiger d，liungdahl-stahle e，et al . antiviral effects of 3 -fluorothymidine and 3 -azi- dothymidine in cynomolgus monkeys infected with simian immunodeficiency virus j . j acquir immune defic syndr，1991，4 （5） ：489-498. 6 hahn b h，shaw g m，de cock k m，et al . aids as a zoonosis：scientific and public health implicationj . science，2000，287 （5453） ： 607-614. 7 hirsch v m，olmsted r a，murphey-corb m，et al . an africa primate lentivirus（sivsm）closely related to hiv-2 j . nature，1989，339 （6223） ：389-392. 8 gao f，yue l，white a t，et al . human infection by genetically diverse sivsm-related hiv-2 in west africa j . nature，1992，358 （6386） ：495-499. 9 gao f，yue l，robertson d l， et al . genetic diversity of human immunodeficiency virus type 2：evidence for distinct sequence subtypes with differences in virus biologyj . j virol，1994，68 （11） ：7433-7447. 10 chen z，telfier p，gettie a，et al . genetic characterization of a new west african simian immunodeficiency virus sivsm：geographic clustering of household-derived siv strains with human immunodeficiency virus type 2 subtypes and genetically diverse viruses from a single feral sooty mangabey troopj . j virol，1996，70 （6） ： 3617-3627. 11 chen z，luckay a，sodora d l，et al . human immunodeficiency virus type 2（hiv-2）seroprevalence and characterization of a distinct hiv-2 genetic subtype from the natural range of simian immunodeficiency virus in- fected sooty mangabeysj . j virol， 1997， 71 （5） ：3953-3960. 12 bodelle p，vallari a，coffey r，et al . identification and genomic sequence of an hiv type 1 group n isolate from cameron j . aids res and hum retroviruses，2004，20 （8） ：902-908. 13 simon f，mauclere p，roques p，et al . identification of a new human immunodeficiency virus type 1 distinct from group m and group oj . nature medicine，1998，4 （9） ：1032-1037. 14 santiago m l，rodenburg c m，kamenya s，et al . sivcpz in wild chimpanzeesj . science，2002，295 （5554） ： 465-468. 15 courgnaud v，salemi m，pourrut x，et al . characterization of a novel simian immunodeficiency virus with a vpu gene from greater spot-nosed monkeys（cercopithecus nictitans）provides new insights into simian/ human immunodeficiency virus phylogenyj . j virol，2002，76 （16） ：8298-8309. 16 corbet s，muller-trutwin m c，versmisse p，et al . env sequences of simian immunodeficiency viruses from chimpanzees in camerron are strongely related to those of human immunodeficiency virus group n from the same geographic area j . j virol，2000，74 （1） ：529-534. 17 mccormick-davis c，dalton s b，singh d k，et al . comparison of vpu sequences from diverse geographical isolates of hiv type 1 identifies the presense of highly variable domains，additional invariant amino acids，and a signature sequence motif common to subtype c isolates j . aids res and hum retroviruses，2000， 16 （11） ： 1089-1095. 18 yamaguchi j，vallari a s，swanson p，et al . evaluation of hiv type 1 group o isolates：identification of five phylogenetic clusters j . aids res and hum retroviruses，2002，18 （4） ：269-282. 19 yamaguchi j，bodelle p，kaptue l，et al . near full-length genomes of 15 hiv type 1 group o isolatesj . aids res and hum retroviruses，2003，19 （11） ：979-988. 20 jarbo c，johansson s，lfberg j. neighbor-joiningeb/ ol . http： / / artedi.ebc.uu.se/ course/ sommar/ njoin/ main.html，2006-01-17 / 2006-02-13. 21 thompson j d，gibson t j，plewniak f，et al . the clustal x windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools j . nucleic acids research，1997， 25 （24） ： 4876-4882. （下转第 315 页） 803 复 旦 学 报 （自然科学版）第 45 卷 physiology， 2002， 129： 440-450. 24 chang t t . the origin， evolution， cultivation， dissemination and diversification of asian and african rices j . euphytica， 1976， 25： 435-441. 25 lu b r， zheng k l， qian h r， et al . genetic differentiation of wild relatives of rice as assessed by rflp analy- sisj . theoretical and applied genetics， 2002， 106： 101-106. differentiation of indica-japonica rice revealed by insertion/ deletion fragments obtained from comparative genomic study of dna sequences between 93-11 （indica）and nipponbare（japonica） cai xing-xing，liu jing，qiu yin-qiu，zhao wei，song zhi-ping，lu bao-rong （ ministry of education key laboratory for biodiversity science and ecological engineering， institute of biodiversity science， fudan university，shanghai 200433，china） abstract：dna polymorphisms resulted in nucleotide insertion/ deletions in genomic sequences are the basis for developing indel molecular markers. in order to validate the indel primer pairs designed based on the comparative genomic study of dna sequences between an indica rice 93-11 and a japonica rice nipponbare，in identifying indica and japonica rice va- rieties，and studying wild oryza species，49 indica，43 japonica and 24 wild rice accessions from 10 asian countries us- ing 45 indel primer pairs were studied. the results indicated that of the 45 indel primer pairs，41 can accurately identify indica or japonica rice varieties with the reliability over 80% . the scatter plotting data of the principal component analy- sis（pca）indicated that（i）the indel primer pairs can easily distinguish between