昆虫杆状病毒载体.ppt

昆虫杆状病毒表达系统,高遄 生物化学与分子生物 2120422,前言,高表达 低成本 安全性高 大规模生产,前言,昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表达系统。利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体，可使很多真核目的基因得到有效甚至高水平的表达。 具有高效表达、基因克隆容量大、重组病毒易于筛选、安全性高、且有完备的翻译后加工修饰系统等特点，现已成为基因工程四大表达系统之一。 利用该表达系统获得重组蛋白可用于药物开发、疫苗生产、生物杀虫剂等多个领域。据文献统计，已有1000 余种外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中得到了成功地表达，其中约有95% 的外源重组蛋白能够被正确的转译后加工修饰，具有与天然蛋白相同的生物活性。,昆虫杆状病毒表达系统,2.杆状病毒载体表达系统的特点,3.昆虫杆状病毒表达系统的应用,1.昆虫杆状病毒表达系统的构成,4. 参考文献,1.昆虫杆状病毒表达系统的构成,1.昆虫杆状病毒表达系统的构成,表达过程 将外源目的基因插入到启动子下游 与杆状病毒重组，获得重组病毒 将重组的病毒纯化 感染昆虫细胞或虫体 外源基因随着病毒的复制而获得表达,1.1 杆状病毒载体,1.1.1杆状病毒简介 杆状病毒是研究细胞分子生物学的重要工具，同时也是外源基因在昆虫细胞中表达的载体。杆状病毒只来源于无脊椎动物，已发现600多种杆状病毒，其中仅有不到20 种进行了分子生物学研究。 杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA 分子， 大小为80 160kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA 复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA 插入，因此是表达大片段DNA 的理想载体。其中, 用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒( nuclear poly hedrosis virus, NPV) 。,1.1 杆状病毒载体,现已知基因组全序列的杆状病毒仅有7 种: 苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒( AcMNPV ) 家蚕核多角体病毒( BmNPV ) 黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒( OpMNPV ) 舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒( LdMNPV ) 甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒( SeMNPV) 棉铃虫核型多角体病毒( HaNPV) 斜纹夜蛾核型多角体病毒( SpltMNPV),1.1 杆状病毒载体,AcMNPV 是昆虫杆状病毒表达系统中最常用的载体，基因表达分为4 个阶段: 立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。 早于DNA 复制 病毒DNA 合成 多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30% 50%，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力。 P10 蛋白为另一类高效表达的极晚期蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。,理想的外源基因插入位点,1.1 杆状病毒载体,载体重组原理：原理是人为将杆状病毒多角体蛋白两翼序列的同源序列引入含外源基因的质粒载体中，通过同源重组方式来实现外源基因对病毒多角体蛋白基因的替换。 由于杆状病毒分子质量约为134kb，不能利用多克隆位点（酶切连接）进行基因重组，只能利用杆状病毒和带有外源基因的质粒载体进行共转染（转移载体的介导）。,多克隆位点：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。 共转染：物理上不相连的基因被整合到同一整合序列并在同一转染细胞内表达的现象。,1.1 杆状病毒载体,1.1.2杆状病毒载体的重组 将极晚期基因( 如多角体基因及其边界区) 克隆入细菌的质粒中 消除其编码区和不合适的酶切位点 保留其5c端对高效表达必需的调控区 在下游引入合适的酶切位点供外源基因的插入，即得到转移载体。 将要表达的外源基因插入其启动子下游 与野生型AcNPV DNA 共转染昆虫细胞 通过两侧同源边界区在体内发生同源重组，使多角体蛋白基因被外源基因取代。,1.1 杆状病毒载体,1.1.3杆状病毒载体的筛选 由于多角体基因被破坏，则不能形成多角体。这种表型在进行常规空斑测定时，可同野生型具有多角体的病毒空斑区别开来， 这就是最初的筛选重组病毒的方式。 由于重组效率较低( 0. 1% 1%) ，表型差别不显著，应用上有一定的困难。,1.1 杆状病毒载体,1.1.3杆状病毒载体的筛选 为此，经过不断探索，在重组杆状病毒的筛选与鉴定方面取得了很大改进。 具体方法有以下几种： -半乳糖苷酶的蓝白筛选 体外酶促定位重组 Bacmid TK 基因 Neo 基因,Bacmid,Luckow 等开发。快速、高效产生重组AcMNPV 病毒。取杆状病毒( baculovirus) 和质粒( plasmid) 的英文字头字尾命名为Bacmid，即杆状病毒质粒之意。 根据F因子载体原理，用类似于酵母体内重组的方法，构建了一种新杆状病毒穿梭载体Bacmid。该载体可像质粒一样在大肠杆菌中生长，又对鳞翅目昆虫细胞具有感染性。 Bacmid 含有F因子复制子( 可在大肠杆菌中复制) 、卡那霉素抗性基因及Tn7 转座位点attTn7。 转移载体中，外源基因置于杆状病毒启动子之下, 两端分别为Tn7的左右端。以其转化含Bacmid的E.coli菌株，由辅助质粒提供反式作用发生转座，而将外源基因转到Bacmid的attTn7位置。,Bacmid,在Bacmid 中，外源基因被核多角体启动子控制，并包含了多种抗性基因及LacZ 缺失标记，极大地方便了重组病毒的筛选及鉴定。这种重组了外源基因的Bacmid转染的昆虫细胞，可得到100%阳性重组病毒 。 操作简单方便，只需1 周即可完成重组病毒载体的构建。,Bacmid,由于我国有养蚕业，还可在AcMNPV Bac-to-Bac表达系统的基础上进行改造，构建能够应用于家蚕的BmNPV Bac-to-Bac 表达系统，这将大大减少传统昆虫杆状病毒表达系统表达外源重组蛋白所需时间，极大地提高了工作效率。还能够解决培养昆虫细胞成本高，难于规模化生产等问题。 重组率100%、操作简便、1 周完成重组、全部操作都在细菌中进行，取名为Bac-to-Bac 表达系统,1.2 昆虫细胞宿主,昆虫细胞在生物学、医学、农业等领域中被作为非常重要的研究工具。 目前全世界建立的昆虫细胞系有800 多株，分别来源于鳞翅目、双翅目、鞘翅目、蜚蠊目、直翅目、膜翅目、同翅目和半翅目8 个目的170 余种昆虫，其中具有实际应用的细胞系大部分来自鳞翅目和双翅目。 以昆虫杆状病毒为载体的昆虫细胞可成功、高效地表达外源基因，生产具有重要药用价值和具备天然活性的重组蛋白。因此，在众多昆虫细胞系中鳞翅目昆虫细胞系应用最为广泛。,1.2 昆虫细胞宿主,昆虫杆状病毒表达系统既可在昆虫培养细胞中，又可在昆虫和蛹内进行表达。究竟在昆虫体内还是在培养细胞中表达外源基因，可根据外源蛋白的性质及其用途、表达水平高低、分离纯化难易、纯化要求高低等因素来考虑。 然而，对于常规小量及高纯度的蛋白质生产而言，利用体外培养的昆虫细胞来进行表达是首选途径。 相对于已知的上百万种昆虫以及昆虫细胞系的广泛用途来说，已经建立的细胞系还远远不够，仍需建立更多的昆虫细胞系以满足实际需要。,Company Logo,2.杆状病毒载体表达系统的特点,安全性高,基因容量大,表达水平高,能进行翻译后的加工修饰,重组蛋白具有完整的生物学功能,2.杆状病毒载体表达系统的特点,相对其他表达系统它具有以下几个方面的特点： 重组蛋白具有完整的生物学功能：杆状病毒表达系统可为高表达的外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物的形成提供良好的环境，可使表达产物在结构及功能上接近天然蛋白。 利用昆虫杆状病毒表达系统来表达富含二硫键的一些具有神经毒性的生物毒素肽将是一个最佳的选择。,2.杆状病毒载体表达系统的特点,能进行翻译后的加工修饰：杆状病毒表达系统具有对蛋白质完整的翻译后加工能力，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等，修饰的位点与天然蛋白在细胞内的情况完全一致。 对比实验证明，在昆虫细胞发生的糖基化位点与哺乳动物细胞中完全一致，但修饰的寡糖种类却不完全一样。这种不一致对不同目的蛋白的活性影响不同，所以昆虫表达系统还可作为一个研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方面的理想模型。,2.杆状病毒载体表达系统的特点,表达水平高：与其它真核表达系统相比较，此系统最突出的特点就是能获得重组蛋白高水平的表达，最高可使目的蛋白的量达到细胞总蛋白的50。 虽然目前科研工作者大都是在细胞培养条件下进行表达外源基因，当条件成熟时需要大量制备某类外源蛋白时，最好采用昆虫幼虫或蛹。因为培养昆虫幼虫和蛹远比培养细胞简单、廉价，而且利用昆虫幼虫或蛹能够显著提高外源基因的表达水平。 利用BmNPV 载体在家蚕幼虫中成功表达出重组蜘蛛牵引丝蛋白，表达量高达每个昆虫活体6mg。一般在幼虫体内的淋巴液中，蛋白质表达量较在细胞培养基中高10倍以上。因此，通过昆虫杆状病毒表达系统可利用昆虫活体大规模生产各种重组蛋白。,2.杆状病毒载体表达系统的特点,基因容量大：昆虫杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80 200kb，其基因组可在昆虫细胞核中复制和转录。DNA 复制后组装在杆状病毒的毒粒内，由于毒粒具有较大的柔韧性，能包装较大的基因片段，可表达非常大( 100kb) 的外源性基因。因此是表达大片段DNA 的理想载体。但目前尚无实验得知杆状病毒所能容纳的外源基因长度的上限。 我们感兴趣的另外一个特点是在昆虫杆状病毒载体内还可多基因同时表达，具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个外源基因的能力。根据设计需要既可采用不同的重组杆状病毒同时感染细胞的形式，也可在同一杆状病毒载体上同时克隆多个外源基因，其表达产物之间可有蛋白质的相互作用或加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体。,2.杆状病毒载体表达系统的特点,安全性高：由于杆状病毒的天然宿主是昆虫，不能在哺乳动物细胞内复制病毒DNA 以及增殖病毒，杆状病毒不会感染人。因此对细胞的生理影响较哺乳类病毒载体要小，同时实验操作者的自身安全也比较有保障。 现有研究也表明其启动子在哺乳动物细胞中没有活性，因此在表达癌基因或有潜在毒性的蛋白质时可能优于其他表达系统。最新研究发现，AcMNPV 病毒作为哺乳动物细胞基因转移载体，也可以将外源基因导入哺乳动物的细胞，如人的肝细胞。这意味AcMNPV 病毒可能成为哺乳动物基因治疗的媒介体，因此杆状病毒有望在未来人类的基因治疗中得到应用。,3.昆虫杆状病毒表达系统的应用,昆虫杆状病毒表达系统广泛应用于药物研发、疫苗生产、重组病毒杀虫剂等众多领域中。其中，在生物分子研究中，具有代表性的是重组蛋白的表达，是目前杆状病毒表达系统应用最多的领域。成功表达出具有药用价值的蛋白质又可用于药物研发和疫苗生产。,3.1 基础研究,功能基因组学（functional genomics）的重要内容是研究基因组内各种蛋白质的结构和功能，蛋白质之间以及蛋白质和核酸之间的相互关系。 实现这一计划的前提是要生产几万种蛋白质 ，这就要求蛋白质表达系统提供新的技术，诸如：通过简单的操作，生产各种活性形式的蛋白质简化操作过程，缩短从基因生产蛋白质的时间以简便的操作，同时生产许多种蛋白质。 最新的研究和技术发展业已表明，昆虫杆状病毒表达系统是解决上述问题的优良系统，以昆虫虫体为宿主是十分有魅力的。 日本片仓公司在这方面进行了卓有成效的探索导入Invitrogen公司的GATEWAY系统 ，利用Bac-to-Bac系统的载体，通过单一的LR Clonase就能同时构建各种带目的基因的BEVS质粒转移载体；用缺失增殖所必须的线型化病毒DNA、含缺失增殖所必需基因的质粒转移载体和外源基因同时感染蚕蛹，通过此法，不用筛选就能在短期内获得正确的重组病毒和目的蛋白，由于使用的是蚕蛹，这种技术还可以自动化操作。,3.2开发医用疫苗和药物,由BEVS生产的疫苗研究早已开始，HIV疫苗于20世纪80年代 ,疟疾疫苗于90年代进人临床 ,但由于这2种疾病的特殊性，所有其他来源的疫苗都缺乏良好保护性，所以未能被使用。 尽管如此，临床试验亦证明了昆虫杆状病毒表达系统来源的重组蛋白对人是安全的。由家蚕宿主昆虫杆状病毒表达系统重组多肤药物国内外尚无产品，其主要障碍在于这是一个新的宿主系统，且发达国家无养蚕业。国内口服重组昆虫杆状病毒表达系统多肤药物已有开发，正进人药物审批阶段，相信昆虫杆状病毒表达系统重组多肤生产医用药物会有较好的前景。,3.3 产业化,在众多应用中，重组病毒杀虫剂作为一类重要的具有开发潜力的生物杀虫剂，将是未来最容易产业化的一条成功之路。 昆虫杆状病毒具有宿主专一、致病力强、传播快、无残留、无抗药性、对脊椎动物和植物安全、不易引起广泛规模的生态平衡的破坏等特点。昆虫杆状病毒作为生物杀虫剂第一次进入市场在20 世纪70 年代，当时是直接使用野生型病毒。实践表明，生物杀虫剂与化学杀虫剂相比，具有杀虫速度慢、杀虫谱窄、成本高等缺点。故使病毒杀虫剂的商品化生产和推广应用受到了很大限制。为此，科研人员通过基因工程方法改造杆状病毒，不仅可以克服野生型病毒的固有缺点，而且为扩大病毒杀虫功能提供了潜在可能。,参考文献,朱帮福,卢兹凡.昆虫杆状病毒表达系统的研究进展.细胞与分子免疫学杂志,2002,18(6):681-683. 高炳淼,李宝珠,于津鹏,胡远艳,长孙东亭,罗素兰. 外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达.