大米蛋白酶解产物抗氧化活性及功能性质研究.pdf

讲究与摆讨 V 0 1 2 9 , N o 0 5 , 2 0 0 8 张君慧，张晖。王兴国。姚惠源 ( 江南大学食品学院，江苏无锡2 1 4 1 2 2 ) 摘要：采用不同的蛋白酶( 木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、精制中性蛋白酶和碱性蛋白酶) 水解大米蛋白。以制 备抗氧化活性肽。结果发现，精制中性蛋白酶水解大米蛋白得到的产物对D P P H 自由基的清除能力最强。而且水解度 其清除能力影响显著。同时测定了酶解产物的还原能力、金属离子螯合能力以及在F e “引发的亚油酸过氧化物体系 中的抗氧化活性，结果表明，此酶解产物表现出一定的还原能力，能够抑制由F e “引发的亚油酸过氧化物体系中的抗 氧化活性，具有一定的金属离子螯合能力。结果表明，这种肽具有一定的抗氧化活性，具有良好的功能特性。 关键词：大米蛋白，酶解产物，抗氧化活性，功能性质 A n t i o x i d a n ta c t i v i t i e sa n df u n c t i o n a lp r o p e r t i e so f r i c ep r o t e i ne n z y m a t i ch y d r o l y s i s ( R P E H ) Z H A N GJ u n - h u i ，Z H A N GH u i ，W A N GX i n g - g u o ，Y A OH u i - y u a n ( S c h o o lo fF o o dS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y ，J i a n g n a nU n i v e r s i t y ，W u x i2 1 4 1 2 2 ，C h i n a ) A b s t r a c t ：5d i f f e r e n tp r o t e a s e sw e r ea p p l i e dt oh y d r o l y z et h er i c ep r o t e i n 。a n dN e u t r a s ew a sc h o s e nt ob et h eb e s t o n eo ft h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i s T h ea n t i o x i d a n ta n df r e er a d i c a l s c a v e n g i n ga c t i v i t i e so fR P E Hw e r ei n v e s t i g a t e d b ye m p l o y i n gs e v e r a li nv i t r oa s s a ys y s t e m s ，i n c l u d i n gt h el i n o l e i ca c i de m u l s i o nm o d e ls y s t e m ，l ，1 一d i p h e n y I 一2 一 p i c r y l h y d r a z y l ( D P P H ) r a d i c a l s c a v e n g i n g ，r e d u c i n gp o w e r ，a n df e r r o u si o n c h e l a t i n ga c t i v i t y R P E Hs h o w e d s c a v e n g i n ga c t i v i t ya g a i n s tf r e er a d i c a l ss u c ha sD P P Hr a d i c a l s M o r e o v e r 。R P E Ha l s oe x h i b i t e dn o t a b l er e d u c i n g p o w e ra n ds o m ec h e l a t i n ge f f e c to nF e “T h ed a t ao b t a i n e db yt h ei n v i t r os y s t e m so b v i o u s l ye s t a b l i s h e dt h e a n t i o x i d a n tp o t e n c yo fR P E H a n dl a i dt h ef o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e rs t u d i e s K e yW O r d s ：r i c ep r o t e i n ；e n z y m a t i ch y d r o l y s a t e s ；a n t i o x i d a n ta c t i v i t i e s ；f u n c t i o n a lp r o p e r t i e s 中图分类号：T s 2 1 0 1文献标识码：A 文章编号：1 0 0 2 0 3 0 6I2 0 0 8 ) 0 5 0 0 7 3 0 5 许多研究证实，氧化与人类及其他动物的许多 疾病，诸如癌症、老化、动脉硬化等的发病机理有 关 引。人体通过适当摄入具有抗氧化活性的物质， 可以降低体内自由基水平，防止脂质过氧化，帮助机 体抵御疾病工J 。目前采用的化学合成类抗氧化剂如 B H T 、B H A 、T B H A 、T B H Q 等，虽然能抑制油脂氧化， 却带来食品安全性的问题，天然抗氧化剂相对来说 更安全，可以长期食用。对于预防和治疗衰老和心 血管病等慢性病，应该着眼于补充抗氧化食物，尤其 是天然食物及其提取物的补充4 p “。蛋白质类天然 抗氧化剂物质中最有前途的当属肽类，肽类不仅在 油溶体系中有良好的增效作用，而且在水溶体系、乳 化体系及干燥体系中也有较高的抗氧化活性“ 一 。 一般说来。肽类的抗氧化能力大于氨基酸，谷胱甘 收稿日期：2 0 0 7 0 8 1 3 通讯联系人 作者筒介：张君恶( 1 9 8 3 一) ，女在读博士，研究方向：功能性粮油食品 组分开发。 基金项目：国家“+ - - e ”支撑计划( 2 0 0 6 B A D 0 5 A 0 1 ) ；“新世纪优秀人 才支持计划资助”项目。 肽、肌肽、鳕鱼多肽等，充分证明了肽类的抗氧化活 性“ 。0 “ 。从经济的角度来看，大米在中国乃至世界 上都是最重要的植物之一，从大米及其加工副产品 中开发出抗氧化食品，原料来源容易、成本低、消费 者容易接受。国内外对大米蛋白抗氧化肽的报道较 少，本文通过酶解实验，获得了抗氧化活性肽，并测 定了其抗氧化活性和功能性质，为从大米蛋白中提 取天然的抗氧化剂提供了理论依据，同时为进一步 分析研究大米蛋白抗氧化肽的结构及其作用机理提 供了基础。 1 材料与方法 1 1 材料与设备 大米蛋白实验室采用碱溶酸沉法自制；蛋白 酶杰能科酶制剂公司；D P P H ( 1 ，1 一d i p h e n y l 一2 一 p i c r y l h y d r a z y l ) 美国S i g m a 公司；其它试剂均为分 析纯。 中草药粉碎机温州温岭机械厂；超级恒温水 浴上海市实验仪器厂；P H S - 2 型酸度计、7 2 1 型分 光光度计上海第二分析仪器厂；I X L 型沉淀离心机 万方数据 坠塑坐 讲究与摆讨 S c i e n c ea n dT e c h n o l o g yo fF o o dI n d u s t r y 。 上海医用分析仪器厂；L G J 一1 0 冷冻干燥机北京 四环科学仪器厂。 1 2大米蛋白的制备及大米蛋白酶解肽的工艺路线 大米粉碎，过8 0 目筛，取筛下物按I ：1 2 ( w v ) 的 比例加入0 1 m o l LN a O H 溶液，室温下( 2 5 ) 充分 搅拌浸提2 h ，4 0 0 0 r m i n 条件下离心分离2 0 m i n 。所 得残渣按料水比1 ：6 的比例按上述方法重复浸提一 次，合并两次浸提的上清液，调节上清液的p H 为 5 5 ，4 。C 下静置1 h ，倾去上清液，然后4 0 0 0 r m i n 离心 分离2 0 r a i n ，沉淀用蒸馏水洗涤两次，离心收集沉淀。 所得沉淀经冷冻干燥，制得大米分离蛋白，置于干燥 器中保存备用。 5 ( W V ) 脱脂大米蛋白悬浮液一调p H 一一定温度下 在超级恒温水浴酶反应器中溶解3 0 m i n - - - * 按不同底物浓度、 加酶量、p H 、温度进行酶解( p H S t a t 法使体系p H 稳定) 一 8 5 1 0 m i n 灭酶+ 3 5 0 0 r m i n 离心1 5 m i n _ 上清液_ + 真空浓 缩一冷冻干燥一大米蛋白肽 不同蛋白酶的酶解反应的具体条件如表1 所 示。反应过程中以0 1m o l L 的N a O H 标准溶液维持 酶解液p H 恒定，采用p H S t a t 法测定水解度的 变化。 1 3 分析方法 1 3 1 水解度( D H ) 测定2 1蛋白质的水解度是指 蛋白质水解反应过程中被裂开的肽键的百分数。在 中性和碱性的条件下采用p H S t a t 法，具体公式 如下： 111 D H2B N b 吉毒亡1 0 0 式中，B 为碱液体积( m L ) ；N 为碱液的当量浓 度；O t 为d 一氨基的解离度；M p 为底物中蛋白质的总 量( g ) ；h 。为底物中蛋白质的肽键总数( m m o l g 蛋白 质) 。 1 3 2 大米蛋白酶解物( R P P H s ) 的平均肽链长度 ( t h ea v e r a g ep e p t i d ec h a i nl e n g t h ，P C L ) 的测定 p r 、T 一 ! 塑 1 。“一D H ( ) 1 3 3大米蛋白酶解肽体外抗氧化活性测定 1 3 3 1 D P P H 自由基清除能力列采用C h e n 等人 ( 1 9 9 8 ) 的方法。将干燥的水解产物和过滤产物溶解 在4 m L 蒸馏水中，制得浓度为O 、0 0 4 、0 0 8 、 0 1 2 、0 1 6 、0 2 、0 2 4 ( m v ) 的蛋白质溶液。 添加1 m L4 0 1 L m o L L 的D P P H 自由基的乙醇溶液至 各样品溶液中，2 5 。C 下静置3 0 m i n ，于5 1 7 n m 测定吸 收值。根据下式计算样品中残留的自由基： 剩余的D P P H 自由基( ) = 1 0 0 一 ( D P P H 空 白+ 对照样品) 一D P P H 样品( D P P H 空白) 1 0 0 D P P H 空白：l m L4 0 i x m o l L 的D P P H 自由基的 乙醇溶液加入到4 m L 蒸馏水中测得的吸收值；D P P H 样品：I m L 4 0 i L m o l L 的D P P H 自由基的乙醇溶液加 入到4 m L 样品溶液中测得的吸收值；对照样品：4 m L 样品溶液加入l m L 乙醇溶液中测得的吸收值。 1 3 3 2 还原能力测定4 1 参考O y a i z u 的方法，并略 作改进。用超纯水配制浓度分别为0 2 0 - 2 5 0 m g m L 的R P E H s 溶液。取2 5 m L 于1 0 只1 0 m L 试管中，分 别加入2 5 m L1 铁氰化钾K F e ( C N ) 。，混合均匀， 于5 0 水浴中反应2 0 r a i n 。取出试管，再加入2 5 m L 1 0 三氯乙酸T C A ，混合后以3 0 0 0 r r a i n 离心 1 0 m i n 。取上清液2 5 m L ，加入蒸馏水2 5 m L 、0 1 氯 化铁0 5 m L ，混合均匀，静置l O m i n 后，测定7 0 0 n m 的 吸光值A 。，所有测定值均为三次平均值。 1 3 3 3 酶解产物在亚油酸体系中抗氧化能力测 定一硫氰酸铁法纠 参考O s a w aT 等人的方法，并 作部分调整。将1 0 m LR P E H s 样品及O t 一生育酚和 T B H Q 溶解于1 0 m L5 0 m m o l L ( p H7 0 ) 的磷酸盐缓 冲液中，加入0 1 5 m L 亚油酸和l O m L9 9 5 乙醇，最 后用蒸馏水定容至2 5 m L ，然后密闭置于暗处，4 0 。C 恒温。空白对照以超纯水替代样品及一生育酚和 T B H Q 。过氧化值的测定采用硫氰酸铁法：取0 1 m L 亚油酸混合液，依次加入4 7 m L7 5 的乙醇和0 1 m L 3 0 的硫氰酸铵。再加入0 1 m L0 0 2 m o l L 已经溶解 于3 5 盐酸中的氯化亚铁，快速混匀，准确反应 3 m i n 后，在5 0 0 n m 测定吸光度。0 时刻测定值为A 。， 以后每隔2 4 h 测定一次，计为A t 。样品的抗氧化能 力以1 4 4 h 时的氧化抑制率表示，抑制率按下式 计算： 抑制率 = 垂鲁嚣= 窘褊耠- 0 0 一空白管A 5 0 0 f I - ) 一样品管A 5 0 0 ( I - 0 h ) 1 3 3 4 金属离子螯合能力测定纠参考D i n i sT C P 等人的方法，并略作改进。用超纯水配制浓度分别 为0 1 、0 2 、0 3 、0 4 、0 5 m g m L 的R P E H s 溶液和 E D T A 溶液，取1 m L 样品液，加入0 0 5 m L2 m m o l L 的 F e C I ：溶液和1 8 5 m L 超纯水，? 昆合均匀，再加入 0 1 m L5 m m o l L 的f e r r o z i n e 溶液，剧烈震荡均匀，室 温下静置1 0 m i n ，测定5 6 2 n m 的吸光值A 一。，取1 m L 超纯水代替样品，测定A 。，所有测定值均为三次平 均值。螯合率按下式计算： 螯合率( ) = ( A 。l A 姗p l 。) 。I 。X1 0 0 1 3 4 大米蛋白酶解抗氧化肽的功能性质测定 1 3 4 1 大米蛋白酶解抗氧化肽p H 一溶解度的测 定1采用福林酚试剂法，分别称取0 5 0 9 大米蛋白 酶解抗氧化肽于5 0 m L 不同p H ( 2 1 2 ) 的溶液中，磁 力搅拌3 0 m i n 在1 0 0 0 0 r m i n 下离心1 5 r a i n ，采用福 林酚法测其溶解度。 溶解度S ( ) = 蛋白质含量( 斗g m L ) 上清液 体积( m E ) X 1 0 。X 稀释倍数( WX 样品中粗蛋白质 含量) 1 0 0 其中w 为样品的称样量0 5 0 9 。 1 3 4 2 大米蛋白酶解抗氧化肽起泡性及泡沫稳定 性的测定方法“引 配制5 0 m L1 0 的蛋白质溶液，搅 拌2 0 r a i n ，混合均匀，置于高速匀浆机中1 0 0 0 0 r m i n 搅 打1 m i n ，记录搅打前的液体体积V 。，搅打停止时的泡 沫体积V 。和搅打停止2 、5 、1 0 、2 0 、3 0 、6 0 m i n 后的泡 沫体积V 。起泡性和泡沫稳定性表示如下： 起泡性( F C ) = V V o 1 0 0 泡沫稳定性是通过测定搅拌停止后不同时刻的 泡沫体积占搅拌停止0 m i n 时的泡沫体积的比例来 万方数据 讲究与删弋面丽丽幽 反映( O m i n 时的泡沫体积记为1 0 0 ) 。 2 结果与讨论 2 1 酶源的确定 由表1 及图1 可看出，精制中性蛋白酶具有作用 条件温和、水解度高、酶解产物体外抗氧化活性强 ( E C 。值较低) 的优点，因此，确定精制中性蛋白酶为 酶解大米蛋白的合适酶源。 表1 各种蛋白酶的酶解反应条件及 大米蛋白酶解产物的D P P H 清除能力比较 錾 馥 朝 8 03 06 09 01 2 01 5 01 8 02 l O2 4 02 7 03 0 0 水解时间( 1 1 ) 图1不同蛋白酶水解大米蛋白的工作曲线 2 2 大米蛋白酶解肽的体外抗氧化活性的测定结果 2 2 1 不同水解度的大米蛋白酶解肽的D P P H 自由 基清除能力图2 显示了不同水解度的大米蛋白抗 氧化肽在不同浓度下的自由基清除能力。结果表 明，随着水解度的增加，酶解产物的D P P H 自由基清 除能力呈现递增的趋势，当水解度为1 3 O 时，酶解 产物的D P P H 自由基清除能力较强，因此选取水解 度为1 3 O 的酶解产物做进一步实验。然而，不同 水解度时，大米蛋白抗氧化肽的D P P H 自由基清除 能力均呈现出一定的剂量效应，随着大米蛋白抗氧 化肽浓度的增加，其D P P H 自由基清除能力呈递增 趋势。E C 。( 即自由基清除能力达到5 0 时所需酶 解样品的浓度) 被广泛用于测定自由基清除功效。 E C 。越低，表明该物质的自由基清除能力越高。本实 验结果发现，大米蛋白抗氧化肽自由基清除能力的 E C 为0 0 8 m g m L ，略高于a 一生育酚( 0 1 0 m g m L ) 。 因此推断，大米蛋白抗氧化肽是一种自由基抑制剂， 通过与大量的自由基作用，从而限制发生在人体内 的自由基损伤。 2 2 2D H = 1 3 O 的大米蛋白酶解肽的还原能力 由图3 可知，D H = 1 3 o 的大米蛋白酶解产物的还 原能力很强，而且与样品的浓度呈现出明显规则的 递增趋势。M e i rS 和J u n t a c h o t eT 等人报道，生物活 性化合物的还原能力与其抗氧化能力之间存在有一 定关系钆2 0 J ，本实验结果也证实了酶解产物的还原能 力可能对其抗氧化能力有显著的促进作用。 2 2 3 D H = 1 3 O 的大米蛋白酶解肽在亚油酸体系 中的抗氧化能力图4 为D H = 1 3 0 的酶解产物在 8 0 姊7 0 缕6 0 麓 蛊 1 0 0 O O OO 0 4O 0 80 1 20 1 60 2 00 2 4 水解物浓度( m g m L ) 图2 不同水解度酶解产物的D P P H 自由基清除能力 l0 2 2 0 2 0 j 苫1一一 孰目y = 0 0 9 4 7 3 + 0 胚4 。：。 蓁：j R ：o ，s s ”3 珥。2 1 o 1 0 n 0 8 志万1 F 了j 广五一0 O0 51 O1 52 02 5 图3D H = 1 3 O 大米蛋白酶解肽的还原能力 亚油酸乳化体系中的抗氧化能力，并与O t 一生育酚和 B H T 的抗氧化效果进行了比较。添加酶解产物后， 有效抑制了亚油酸的自动氧化作用，而且酶解产物 的抑制效果接近于O t 一生育酚，但明显低于B H T 。因 此可以推断，大米蛋白的酶解产物中可能含有某些 具有抗氧化作用的肽或氨基酸。S a i g aA 和 R a j a p a k s eN 【2 1 圳报道，蛋白质水解产物和肽类由于疏 水性增加，有利于其在油脂中的溶解性，因此其抗氧 化活性有所增加。 量 8 o 世 采 餐 o1 2 培养时3 间( d 56 图4D H = 1 3 O 的大米蛋白酶解肽在 亚油酸体系中的抗氧化能力 2 2 4D H = 1 3 0 的大米蛋白酶解肽的金属离子螯 合能力F e r r o z i n e 与F e “会形成复合体，在螯合剂存 在的情况下，会阻断复合体的形成，导致红色的复合 体颜色逐渐变淡，因此可以通过颜色的淡化来评价 测定螯合剂的金属离子螯合能力旧”。由图5 所示， E D T A 明显地阻断了复合体的形成；D H = 1 3 0 的大 米蛋白酶解肽具有一定的阻断复合体形成的能力， 因此D H = 1 3 0 的大米蛋白酶解肽具有一定的金属 离子螯合能力。 2 3 D H = 1 3 0 的大米蛋白酶解肽的功能性质 2 3 1 D H = 1 3 0 的大米蛋白酶解肽的p H 一溶解度 曲线由图6 可以看出，p H 在2 1 2 之间，大米蛋白 酶解肽的溶解性都很好，均超过了8 0 。同直接碱 提得到的大米蛋白相比，其溶解性有大幅度提高。 这可能是由于分子量更小、亲水性更强、溶剂化能力 更强的肽类生成引起的1 ，此性质将有助于拓展肽 万方数据 坠塑坐 研究与敷讨 S c i e n c ea n dT e c h n o l o g yo fF o o dI n d u s t r y 。 。 。 1 0 0 邑8 0 R 龊6 0 司 翱4 0 寝2 0 举 O O2 0 04 0 06 0 08 0 01 0 0 0 浓度0 t g m L ) 图5D H = 1 3 0 的大米蛋白酶解肽的金属离子螯合能力 类的应用范围。 8 0 7 0 6 0 世5 0 懿 2 0 1 0 246S1 01 2 p H 图6D H = 1 3 O 的大米蛋白酶解肽的溶解性质 2 3 2D H = 1 3 0 的大米蛋白酶解肽的泡沫稳定性 蛋白质的起泡性是指它在气一液界面形成坚硬的 薄膜，使大量气泡并入和稳定的能力。由于蛋白质 分子具有典型的两亲结构，因而在分散液中能表现 出较强的临界活性，具有在一定程度上降低界面张 力的作用】。由图7 可以看出。D H = 1 3 0 的大米 蛋白酶解肽具有一定的起泡性，而且其泡沫稳定性 很好，静置1 5 h 后，其泡沫体积还可以保持在 2 6 2 m L ，泡沫保持率在8 7 3 。 3 0 o2 4 g 嚣1 8 羹1 2 璎6 0 8 0 季 6 0 骼 。o 墓 2 0 粪 O O 2 04 0 6 0 8 0 1 0 0 静置时间( h ) 图7D H = 1 3 0 的大米蛋白酶解肽的泡沫稳定性 3 结论 通过酶解的方式水解大米蛋白，可以得到具有 抗氧化活性的肽类，而且精制中性蛋白酶的水解效 果最好。酶解产物的冻干样品具有较高的D P P H 自 由基清除能力，而且水解度对酶解产物的D P P H 自 由基清除能力影响显著。同时发现，酶解产物表现 出一定的还原能力，能够抑制由F e “引发的亚油酸 过氧化物体系中的抗氧化活性，具有一定的金属离 子螯合能力。实验结果证实，这种肽具有一定的抗 氧化活性。具有良好的功能特性，为从大米蛋白中提 取天然的抗氧化剂提供了更有力的证据，同时为进 一步研究大米蛋白抗氧化肽的结构、体内抗氧化特 性以及作用机理提供了基础。 ! 参考文献： 1 陈炳卿营养与食品卫生学( 第四版) M 北京：人民 娜运殉 卫生出版社，2 0 0 2 6 3 6 6 ，1 1 5 - 1 1 6 ，1 3 0 2 陈君石，闻之梅食物、营养与癌症预防 M 上海：上 海医科大学出版社，1 9 9 9 4 5 5 - 4 5 7 3 李胜利营养与膳食 M 北京：人民卫生出版 社，2 0 0 4 4 4 4 方允中，杨胜，伍国耀自由基、抗氧化剂、营养素与健康 的关系 J 营养学报，2 0 0 3 ：2 5 ( 4 ) ：3 3 7 - 3 4 1 5 顾景范现代临床营养学 M 北京：科学出版社 2 0 0 3 1 2 0 - 1 2 2 ，1 3 9 ，1 4 5 ，9 4 1 0 4 ，2 7 5 - 2 7 8 ，6 3 1 6 彭德翔，丁卓平抗衰老活性肽的研究进展 J 现代食 品科技，2 0 0 6 ，2 2 ( 2 ) ：2 6 7 - 2 7 0 7 H a t t o r iM ，Y a m a j i T s u k a m o t oK ，K u m a g a iH A n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yo fs o l u b l ee l a s t i np e p t i d e s J JA s r i eF o o d C h e m ，1 9 9 8 ，4 6 ( 6 ) ：2 1 6 7 2 1 7 0 8 J e o nY o u J i n I m p r o v e m e n to ff u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fc o d f r a m ep r o t e i nh y d r o l y s a t e su s i n gu h i f i h r a t i o nm e m b r a n e s J P r o c e s sB i o c h e m i s t r y ，1 9 9 9 ，3 5 ( 5 ) ：4 7 1 4 7 8 9 K a n s e i G T h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t y o fe a m o s i n ea n di t s c o n q u e n c e s o nt h ev o l a t i l e p r o f i l e s o f l i p e s o m e sd u r i n g i m r d a s e o r b a t ei n d u c e dp h o s p h o l i p i do x i d a t i o n J C h i n ，1 9 9 7 ， 6 0 ：1 6 5 1 0 H u iZ h a n g ，F e n gC h e n ，X iW a n g ，H u i Y u a n Y a o E v a l u a t i o no fa n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fp a r s l e y ( P e t r o s e l i n u m c r i s p u m ) e s s e n t i a lo i la n di d e n t i f i c a t i o no f i t sa n t i o x i d a n t c o n s t i t u e n t s J F o o dR e s e a r c hI n t e m a t i o n a l ，2 0 0 6 ，3 9 ：8 3 3 8 3 9 11 A d l e r - N i s s e nJ E n z y m i ch y d r o l y s i so ff o o dp r o t e i n s M U K ：E l s e v i e rA p p l i e dS c i e n c eP u b l i s h e r s ，1 9 8 6 9 5 6 ，11 0 1 6 9 1 2 C h e nHM ，M u r a m o t oK ，Y a m a u c h iF ，F u j i m o t oK ， N o k i h a r akA n t i o x i d a t i v ep r o p e r t i e so fh i s t i d i n e c o n t a i n i n g p e p t i d e sd e s i g n e df r o mp e p t i d ef r a g m e n t sf o u n di nt h ed i g e s to fa s o y b e a np r o t e i n J J o u r n a lo fA g r i c u l t u r a la n dF o o dC h e m i s t r y ， 1 9 9 8 ，4 6 ：4 9 - 5 3 1 4 O y a i z uM S t u d i e so np r o d u c t so fb r o w n i n gr e a c t i o n s ： a n t i o x i d a t i v ea c t i v i t i e so fp r o d u c t so fb r o w n i n gr e a c t i o np r e p a