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高效液相色谱法分析硝基苯甲酸异构体毕 业 设 计 说明书设计题目：高效液相色谱法分析硝基苯甲酸异构体 班 级： 姓 名： 指导老师： 完成时间：2011-06-10化学工程系毕业设计（论文）任务书设计题目：高效液相色谱法分析硝基苯甲酸异构体一、设计学生姓名 ： 崔春波二、题目说明本题应达到的基本要求（包括原始数据，计算，图表）1.学会利用互联网搜集课题有关信息，查阅文献 2.了解高效液相色谱仪的结构和工作原理3.掌握agilent 1100高效液相色谱仪及工作站的使用方法4.优化硝基苯甲酸异构体分离条件5.用不同方法对对硝基苯甲酸进行定量分析6. 写出完整论文三、 题目进度安排1、3-4周：查阅文献、设计实验方案2、5-6周：实验方案讨论、准备仪器药品3、7-15周：实验阶段4、16周：撰写论文5、17周：毕业论文答辩交出任务日期：2011年3月9日；完成日期：2011年6月10 日学生交出全部设计（论文）期限：2011年6月10 日指导教师： 学生签名：高效液相色谱法分析硝基苯甲酸异构体摘要随着高效液相色谱这一新型分离分析技术的广泛应用，现在每天都有许多色谱工作者在研究使用高效液相色谱。特定样品的最佳分离条件，只有通过实验才能得到。本文便是运用安捷伦1100高效液相色谱仪分析硝基苯甲酸异构体，探索分离硝基苯甲酸异构体的最佳分离实验条件。关键词：高效液相色谱 硝基苯甲酸 分离条件hplc analysis nitro benzoic acid isomersabstractwith the high performance liquid chromatography separation and analysis of this new technology widely used, and now every day, many workers in studies using high performance liquid chromatography chromatography. the optimal conditions for a particular sample, can be obtained only by experiment. this article is based on the use of agilent 1100 hplc analysis of nitro-benzoic acid isomers, separation of nitrobenzoic acid isomers to explore the best separation conditions.key words: high performance liquid chromatography; nitro benzoic acid isomers; separation conditions1 前言高效液相色谱自20世纪70年代问世以来，经过近30的发展，在基础理论、仪器装置和色谱柱等方面的研究已趋于成熟，现在已成为化学学科中最有优势的分离分析方法之一。高效液相色谱的应用范围十分广泛，几乎能够分析所有的有机、高分子、生物样品。据估计，目前已知的化合物中，有80%的化合物需要用高效液相色谱法进行分离分析。此外，对无机物的分析也有很好的效果，特别是对生命活性物质的分离分析，有着其它分析方法不可替代的作用，已广泛应用于石油化工，生物化学、临床医学、食品卫生、环境检测、医药工业、商品检验、地质勘探、油田开发等领域的分离分析。对硝基苯甲酸( p -nba ) 是一种重要的有机合成中间体, 是合成许多药物、染料的基础原料。但在合成过程中, 相应产生邻硝基苯甲酸( o-nba ) 与间硝基苯甲酸( m-nba ) 。因此, 探讨它们混合物的分离分析对合成反应过程分析及相关化合物异构体之间的分析具有重要意义。本文采用hplc 法研究这类异构体混合物的分离方法, 可为在合成p -nba 过程中提供中控分析, 也可为其他类似的同分异构体之间的分离分析探索一种方法。 agilent 1100系列组件外形设计独特、具有灵活多变的组合方式；卓越的系统性能指标；图形化的工作站友好界面，完善色谱分析领域。在本文中详细介绍了agilent 1100高效液相色谱仪的操作规程和各种参数的设定。本文便是运用agilent 1100高效液相色谱仪来分析硝基苯甲酸异构体，探索最佳分离条件。2 高效液相色谱仪高效液相色谱（high performance liquid chromatography, hplc）也叫高压液相色谱（high pressure liquid chromatography）、高速液相色谱（high speed liquid chromatography）、高分离度液相色谱（high resolution liquid chromatography）等。是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。又因分析速度快而称为高速液相色谱。 高效液相色谱是目前应用最多的色谱分析方法，高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。hplc的输液泵要求输液量恒定平稳；进样系统要求进样便利切换严密；由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。hplc应用非常广泛，几乎遍及定量定性分析的各个领域。 使用高效液相色谱时，液体待检测物被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛的应用于化学和生化分析中。高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。2.1组成及工作原理带有预柱的 hplc 仪器结构图高效液相色谱仪现在都是由一个个单元组件，然后根据分析要求将各所需要单元组件组合起来，最基本的组件是高压输液系统、进样器、色谱柱、检测器和工作站（数据处理系统）。此外可根据需要配置自动进样器、预柱、流动相和在线脱气装置和自动控制系统等装置。图2-1是普通配制的带有预柱的hplc的结构图。高效液相色谱仪的工作流程：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入流动相，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时, 经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程, 各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到工作站，检测到到的信号在工作站记录、处理和保存，数据以图谱形式打印出来。2.2液相色谱仪的应用高效液相色谱法只要求样品能制成溶液, 不受样品挥发性的限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。hplc能在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力，与试样预处理技术相配合,hplc 所达到的高分辨率和高灵敏度, 使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能,能够分离复杂相体中的微量成分。随着固定相的发展, 有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成其分离。由于hplc具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用, 流出组分易收集等优点,因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域，成为解决生化分析问题最有前途的方法。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。液相色谱- 质谱连用技术受到普遍重视, 如分析氨基甲酸酯农药和多核芳烃等; 液相色谱- 红外光谱连用也发展很快,如在环境污染分析测定水中的烃类, 海水中的不挥发烃类, 使环境污染分析得到新的发展。3 安捷伦1100高效液相色谱仪操作方法3.1 开机 （1）把用隔膜真空泵过滤的流动相放入溶剂瓶中，用专用注射器将溶剂瓶中的溶剂（已过滤的10%30%异丙醇水溶液）引流冲泵，带有控制阀的管路（软管）最后控制在6-10滴/min。 （2） 打开计算机,进入windows nt （或windows 2000）画面,并运行bootp server程序（自动运行）。（3）打开 1100 lc 各模块电源，进行自检。 （4）bootp server中出现7行命令行后，双击instrument 1 online图标，化学工作站自动与1100lc通讯，进入的工作站画面。 （5）从“view”菜单中选择“method and run control”画面, 单击”view”菜单中的“show top toolbar”，“show status toolbar”，“system diagram”， 使其命令前有“”标志，来调用所需的界面。 （6）打开purge阀（泵上黑色旋钮）。 （7）单击pump图标，出现参数设定菜单，单击setup pump选项，进入泵编辑画面。 （8）设flow：5ml/min，设a通道100%，单击ok。（9）单击pump图标，出现参数设定菜单，单击pump control选项，选中on，单击ok，则系统开始purge，直到管线内无气泡从废液管排出为止,切换通道 继续purge，直到所有要用通道无气泡为止。 （10）单击pump图标，出现参数设定菜单，单击pump control选项，选中off，单击ok关泵， 关闭purge 。 （11）单击pump图标，出现参数设定菜单，单击setup pump选项，进入pump编辑画面，设flow：1.0ml/min。 （12）单击泵下面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积，一般设为0.1l停泵，单击ok。 3.2 数据采集方法编辑 1、开始编辑完整方法：从“method”菜单中选择“edit entire method” 项，如上图所示选中除“data analysis ”外的三项，单击ok，进入下一画面。 2、方法信息：在“method comments”中加入方法的信息（如：方法的用途等）。单击ok 进入下一画面。 3、泵参数设定：（以二元泵为例）在“flow”处输入流量,如1ml/min，在“solvent b”处输入70.0,(a=100-b) ,也可insert 一行”timetable” ,编辑梯度。在“pressure limits max”处输入柱子的最大耐高压（330bar），以保护柱 子。 单击ok进入下一画面。4、vwd检测器参数设定 在”wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm, 在”peak width (response time)”下方点击下拉式三角框,选择合适的响应 时 间, 如0.1min (2s)。 在timetable 中可以“insert”一行，输入随时间切换的波长，如1min ，波长=300nm。点击ok进入下一画面。5、柱温箱参数设定:在”temperature”下面的方框内输入所需温度,并选中它,点击“more”键,如图所示,选中”same as left”-使柱温箱的温度左右一致。 点击ok进入下一画面。6、在“ run time checklist ”中选中“data acquisition”。单击ok进入下一画面。7、 单击“method”菜单，选中“save method as”，输入一方法名，如“test”，单击ok进入下一画面。8、从菜单 “view”中选中”online signal” ,选中windows 1,然后单击change 钮,将所要绘图的信号移到右边的框中,点击ok进入下一画面.(如同时检测二个信号,则重复12,选中windows 2)。9、从“run control ”菜单中选择“sample info”选项，如上图所示，输入操作者名称，在“data file ”中选择“manual”或“prefix”。区别: manual-每次做样之前必须给出新名字,否则仪器会将上次的数据覆盖掉。prefix在prefix 框中输入前缀，在counter 框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如vwd0001，vwd0002。10、从instrument 菜单选择system on。11、等仪器ready，基线平稳，从method菜单中选择“run method”（f5），进样。如果是手动进样也可直接从loadinject，分析开始。3.3 手动进样 1、吸入样品 先把进样针洗干净，然后用样品再润洗5次，以确保进样无杂质并确保针内没有吸进微小气泡。2、进样动作 在load状态推针（图a），动作要平缓，以防样品冲出，进样后先切换到inject状态（图b），分析完后再切换到load状态，再拔针，以防倒吸，产生气泡。3、进样量 进样量要么小于定量环（毛细管，有虹吸现象）体积的一半，要么满刻度进样（需要推进35倍定量环体积的样品）否则进样体积无重现性。4、清洗 在inject状态下清洗进样口。5、废液口 废液管的出口末端应与进针口水平，以防样品倒流泄漏或产生虹吸。3.4数据分析方法编辑 1、从“view”菜单中，单击“data analysis”进入数据分析画面。2、从“file”菜单选择“load signal”，选中您的数据文件名，单击ok。3、 做谱图优化,从“graphics”菜单中选择“signal options”选项，。从ranges中选择auto scale及合适的显示时间，单击ok,或选择”use ranges” 调整。反复进行，直到图的比例合适为止。 4、积分: (1)、从“integration”中选择 “auto integrate”,如积分结果不理想,再从菜单中选择“integration events”选项，选择合适的slope sensitivity，peak width，area reject，height reject。 (2)、从“integration”菜单中选择“integrate”选项， 则数据被积分。 (3)、如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。 (4)、单击左边“”图标，将积分参数存入方法。5、打印报告: (1)、从“report”菜单中选择“specify report”选项，进入如上画面。(2)、单击“quantitative results”框中calculate右侧的黑三角，选中percent（面积百分比），其它选项不变。(3)、单击ok.(4)、从“report”菜单中选择“print report”，则报告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则单击report 底部的“print”钮。3.5 关机 1 关机前，用 100%的水冲洗系统20分钟，然后用有机溶剂冲洗系统10分钟（如acn），待基线平稳，然后关泵，（适于反相色谱柱）。正相色谱柱用适当的溶剂冲洗 2 退出化学工作站，及其它窗口，关闭计算机（用shut down关）。3 关掉agilent 1100电源开关。4 药品及实验部分4.1药品及仪器实验仪器：1、agilent1100高效液相色谱仪：可变波长检测器（g1314a） c8柱（4.6150mm，5um），四元泵（g1311a） 真空在线脱气机( g1319a )。2、隔膜真空泵 型号：gm-0.33 津腾2003年3月3、真空干燥箱 型号：dzf-6050 上海精宏实验设备有限公司 4、梅特勒-托利多b-s系列天平 型号：ab135-s 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司5、移液枪 型号：吉尔森p200 北京吉尔森科技有限公司 6、容量瓶（50ml） 烧杯 玻璃棒 胶头吸管实验药品：邻硝基苯甲酸：分析纯 天津市光复精细化工研究所 2004年1月2日间硝基苯甲酸：化学纯 天津市光复精细化工研究所 2003年7月11日对硝基苯甲酸：分析纯 异丙醇：色谱纯 天津市佳兴化工玻璃仪器工贸有限公司 2003年10月23日甲醇：色谱纯 天津市佳兴化工玻璃仪器工贸有限公司 2003年06月08日水：娃哈哈纯净水 2011年 02年07月乙酸：分析纯 天津市博迪化工有限公司 2007年11月01日4.2实验方法对硝基苯甲酸（p-nba）是很重要的药物合成中间体，如将p-nba还原，可以产生对氨基苯甲酸。p-nba的纯度对产品的产率影响很大，一般要求p-nba的纯度要在99.5%以上。然而，p-nba中总是含有少量（约0.5%）的异构体杂质领硝基苯甲酸（o-nba）和间硝基苯甲酸（m-nba）。因此，要准确定量p-nba，首先要将这几种异构体分离。本文采用反相hplc分离这3种异构体，分离的原理是基于异构体之间极性的微小差异，在甲醇（或异丙醇）和水中的溶解度有微小的不同（分配系数不同），因而有可能实现三者的分离。nba是有机酸，在水中可部分离解成酸根阴离子，使之在流动相中的分配系数变得很大，在反相键和固定相c8中的保留变小，异构体相互之间可能完全不能分离。因此，在流动相中需加入有机酸以抑制nba的解离，这是实现分离的关键。本文在流动相中加入乙酸就是这个目的。1.溶液的配制 硝基苯甲酸（nba）标准溶液（1000ug/ml）：准确称取分析纯的o-、m-和p-nba各50mg于不同的烧杯中，用乙醇溶解并分别定容于50ml容量瓶，其浓度均为1000ug/ml。使用时可用乙醇或流动相稀释510倍，即浓度为100200ug/ml；样品称量前/mg称量后/mg样品质量/mg领硝基苯甲酸13530.9213480.6350.29间硝基苯甲酸12769.4512719.2450.21对硝基苯甲酸13630.9113580.5950.32配制后的浓度：邻硝基苯甲酸：1005.8ug/ml间硝基苯甲酸：1004.2ug/ml对硝基苯甲酸：1006.4ug/ml混合标准溶液：分别用p200移液枪取p-nba（100ug/ml），o-nba（100ug/ml），m-nba（100ug/ml）各0.1ml于1ml小瓶中，用乙醇或流动相稀释至刻度。此混合溶液含p-nba10ug/ml，含o-nba和m-nba各10ug/ml；注：所有样品都要用0.45um有机滤膜减压过滤2 分析（1）按仪器操作说明开机，使仪器处于工作状态。（2）设置色谱参数：agilentc8色谱柱（4.6150mm，5um）；流动相（a）为异丙醇：水=20：80（体积比）；流动相（b）为异丙醇：水：乙酸=20：80：0.4（体积比），ph值约为23；流速1.0ml/min；色谱柱温度为室温；可变波长检测器检测波长为254nm。（3）先用流动相（a），待基线稳定后，通过六通阀注入硝基苯甲酸异构体各种样品标样，每次进35次，观察样品峰的重现性。（4）在步骤（3）的基础上，改变进样量和进样浓度，分析出最佳进样量和进样浓度。（5）根据步骤4结果配制相对应的混合标样，通过六通阀注入混合标样，当样品中所有色谱峰出完后，即可停止分析。（6）改用流动相（b），待基线稳定后，再次手动注入标准单样。分析比较各单样保留时间。（7）用流动相b，待基线稳定后，通过六通阀注入混合标样，分析谱图。（8）比较两种流动相的分离效果。3 注意事项：（1）按实验室提供的仪器操作规程操作仪器。 （2）流动相中ph值可按实际分离情况进行调节。4 数据处理：将流动相中含有乙酸和不含乙酸时各异构体的保留时间，峰高或峰面积整理成表，比较两种情况下的分离效果。如下表：硝基苯甲酸异构体单样加酸不加酸比较 次数样品 保留时间/min123平均值邻硝基苯甲酸不加酸1.1411.1161.1351.131加酸2.7472.7382.7352.740间硝基苯甲酸不加酸3.0072.9952.9712.991加酸8.2498.2438.2428.245对硝基苯甲酸不加酸3.23.2173.2033.207加酸9.5739.4879.4089.484硝基苯甲酸异构体混样加酸不加酸比较试样 次数保留时间/min123平均值混样不加酸邻硝基苯甲酸2.0061.9051.9121.941间硝基苯甲酸3.5603.1173.0913.256对硝基苯甲酸4.0133.4743.4313.306混样加酸邻硝基苯甲酸2.7162.7162.7082.713间硝基苯甲酸8.1158.0998.0548.089对硝基苯甲酸9.3269.3049.2539.2945 结果分析由以上表格内容和谱图（见附录）分析结果可知，在用高效液相色谱法分析硝基苯甲酸异构体的过程中，实验条件的改变对定性结果有非常重要的影响。在不加酸的样品分析中，样品峰的保留时间小，而且谱图峰有杂峰，混样分析中样品峰不能很好的分离，有拖尾的现象。而在加酸以后，样品分析过程中可以看出，样品峰的保留时间长，混样分析中样品能够很好的分离。 这是因为硝基苯甲酸是有机酸，在水中可部分离解成酸根阴离子，使之在流动相中的分配系数变得很大，在反相键和固定相c8中的保留系数变小，这样会使硝基苯甲酸异构体相互之间可能完全不能分离。因此，在流动相中加入有机酸乙酸，就是是为了抑制硝基苯甲酸的解离，这是实现硝基苯甲酸分离的关键。致谢本毕业论文是在我的指导老师牛老师的悉心指导下完成的。在本实验完成之际，首先要感谢我的指导老师牛老师，在实验过程中，牛老师严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。从课题的选择到实验的最终完成，牛老师都始终给予我们细心的指导和不懈的支持。一直以来，在牛老师的指导下，我们不仅学会了相关的专业知识，更懂得在以后的工作中要有良好的职业素质，并不断的提升自己的道德修养。其次我要感谢在实验过程中给予我们帮助的老师和同学。正因为有了他们无私的帮助，我们的实验才可以顺利完成。在这里我要向老师们致以我最真挚的谢意。经过三个多月的长时间的努力，我的毕业设计终于完成了。这是一次综合学习化学仪器分析的过程。在此期间我了解和掌握了一些化学仪器的使用方法，例如高效液相色谱仪、隔膜真空泵、真空干燥箱等。同时培养了动手能力和分析问题解决问题的能力，特别是在使用高效液相色谱仪的过程中，学到了很多知识。这为我们将来的发展提供了很多机会。经过这次毕业设计，我深深的体会到严谨、认真、仔细、有耐心是一个化学分析工作人员必须具备的素质。在这次设计过程中，我也发现了自己的许多不足。首先是对安捷伦1100高效液相色谱仪英文化学工作站的了解还不够全面，不能够熟练的运用工作站进行谱图分析，其次是对本次设计没有一个清晰的思路，考虑问题不是很全面，在遇到问题时不能迅速解决。再次，我应该提高查阅英文文献的能力，不断提高自己的专业能力。我要感谢我的母校承德石油高等专科学校，在这个良好的学习环境里，给了我展现自己的舞台，是母校，为我们提供了优越的学习环境，使我们顺利完成学业；是母校，使我们完成人生最美的蜕变。是母校，让我在生活、学习、思想道德，文化修养等方面都有了不同层次的提高，再次感谢我的母校。另外，感谢三年来传授我知识与智慧的老师们。正是由于他们的传道、授业、解惑，让我学到了专业知识，并从他们身上学到了如何求知，如何为人。悠悠三载，转眼而逝。这3年，我们得到了老师们的谆谆教导，学会勇敢坚强与如何追求自己的人生价值。这3年，我们受到老师为人师表与纯正校风的熏陶，懂得了为人处事的道理。这3年，我们更从天真烂漫的无知少年逐渐成长为一个全面发展的有理想青年。最后，再次向我最敬爱的老师们致以最深深的敬意 参考文献1 陈培榕，李景虹，邓勃主编，现代仪器分析实验与技术，清华大学出版社，2006.12 张庆合，高效液相色谱实用手册，化学工业出版社，2008.13 黄一石，吴朝华，杨小林主编，仪器分析，化学工业出版社，2008.14 梁奕昌，义志忠，蔡志红，朱广一，硝基甲苯与硝基苯甲酸异构体的高效液相色谱法分析，色谱，1997.17（4）；3973985 蔡志红，硝基甲苯与硝基苯甲酸混合物的高效液相色谱分析研究，分析实验室，1997.16（6）；50536 赵轶男，高效液相色谱技术(hplc) 影响因素的选择，分析实验室，2007.12；3403417 韩锦屏，王爱华，朱文彬，关于液相色谱仪的日常使用注意事项，江苏现代计量，2008.3；39408 刘萍，侯西成，郝满良，高效液相色谱仪使用中常见的问题及解决方法，饲料博览，20079 于世林，高效液相色谱方法及应用，化学工业出版社，2001.110 陈康，高效液相色谱仪基本结构及使用，仪器原理与使用，2009.24（01），373911 高向阳，新编仪器分析试验，科学出版社，2009.112 宋虎跃，徐国栋，吴勇民，高效液相色谱技术的应用，内蒙古石油化工，2007.6,1718附录附录1 液相色谱仪维护保养及使用注意事项 1、保持贮液瓶清洁，对专用贮液瓶应定期清洗；用试剂瓶作贮液瓶时，要经常更换。2、色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（如acn适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）3、 对于手动进样器，当使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口，同时搬动进样阀数次，每次数毫升。 4、流动相使用前都必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。 5、带seal-wash的 1100，要配制90%水+10%异丙醇，以每分23滴的速度虹吸排出，溶剂不能干涸。 6、每天开始使用仪器，注意放空排气，确保泵头、流动池以及其它流路系统中无气泡存在。 7、避免泵启动过速、升压过快、样品阀搬动过慢所造成的柱压大的波动。8、做完试验，及时用适当溶剂冲洗柱子和进样阀，尤其是对过夜的柱子和进样阀，一定要用足量的水彻底洗净其中的盐类、缓冲液，再用甲醇或乙腈冲洗。9、g1379a型号真空在线脱气机切记不能用5ml/min流速排空气泡，而且进样分析流速设置不宜超过1.5ml/min。10、日常分析基线平稳的标准为：常量分析为12mau，痕量分析为0.5mau附录2 液相色谱仪常见问题处理一 压力波动大,流量不稳定 原因系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物,使得两者不能密封。处理工作中注意观察流动相的量,保证不锈钢滤器沉入储液器瓶底,避免吸入空气,流动相要充分脱气。如为单向阀和阀座之间夹有异物,拆下单向阀,放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗。 二 出峰不佳,峰分叉 色谱柱被污染，处理这种情况,先用纯水反向冲洗柱子,然后换成甲醇冲洗,接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定),再换成甲醇冲洗,然后用纯水冲洗,最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。如冲洗后依然出峰不佳，可能是柱头填料塌陷。三 峰面积重复性不佳 原因：(1)进样阀漏液; (2)加样针不到位。 (3)液量不足. 处理对于第一种情况更换进样阀垫圈;对于第二种情况保证加样针插到底,注射样品溶液后须快速、平稳地从load状态转换到inject状态,以保证进样量的准确。日常工作中,液相色谱仪的保养非常重要,如要注意不要让空气进入输液系统和高压泵中,储液器内的溶液如长时间未用应清洗储液器并更换溶液,每次用完色谱仪后缓冲液要用纯水冲洗干净,防止无机盐析出或沉积;样品的前处理也很重要,任何样品都要尽可能地去除杂质,完全溶解,尽量减少对色谱柱的污染,以延长色谱柱的使用寿命,同时避免注射过浓的样品溶液,以免残留液在进样阀内析出固体引起堵塞;色谱柱作好标记,用于不同分析目的的色谱柱不要混用等。四 压力波动大，基线不稳定（1）问题现象：排完气泡，用b、d通道进80%水，20%异丙醇流动相一段时间时，基线一直不稳，压力波动很大。（2）潜在原因：1：系统中有空气，真空脱气机出现问题； 2：泵中单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物，使得两者不能密封； 3：比例阀可能损坏； 4：流动相经0.45um滤膜过滤后一段时间又存在杂质。（3）解决方案：1.将流量设为0ml/min，将c8柱头卸下，流动相不通过检测器； 2.将流量设为1ml/min，压力由26bar下降至13bar，但有波动； 3.用d通道异丙醇做流动相，流量设为3ml/min，压力最后稳定在8788bar4.用d通道异丙醇做流动相，流量设为1ml/min，压力最后稳定在29bar； 5.用b通道80%水、d通道20%异丙醇做流动相，流量为1ml/min，压力在2619bar间波动； 6.用b通道100%水做流动相，流量设为1ml/min，压力最后稳定在13bar； 7.再次用b通道80%水、d通道20%异丙醇做流动相，流量为1ml/min，压力在269bar间波动，时间越长，波动越大； 8.用a通道100%甲醇做流动相，流量设为1ml/min，压力最后稳定在9bar； 9.用a通道20%甲醇、b通道80%水做流动相，流量设为1ml/min，压力最后稳定在18bar； 10.用新过滤的异丙醇做流动相，放到c通道溶剂瓶； 11.分别用c、d通道流动相，观察压力稳定在29bar左右； 12.用b通道80%水、c通道20%异丙醇做流动相，流量设为1ml/min，压力最后稳定在25bar； 13.用b通道80%水、d通道20%异丙醇做流动相，流量设为1ml/min，压力最后稳定在2524bar； 14.将c8柱头安装好，接通检测器，观察基线状况； 15.用a通道100%甲醇做流动相，流量设为1ml/min，压力最后稳定在44bar，基线最后稳定在-17mau； 16.用b通道100%水做流动相，流量设为1ml/min，压力最后稳定在67bar；基线最后稳定在-48mau； 17.用c通道100%异丙醇做流动相，流量设为1ml/min，压力最后稳定在162bar；基线最后稳定在67mau； 18.用d通道100%异丙醇做流动相，流量设为1ml/min，压力最后稳定在162bar；基线最后稳定在67mau，与c通道没有太大差异； 19.用b通道80%水、c通道20%异丙醇做流动相，流量设为1ml/min，压力最后稳定在133134bar，基线最后稳定在-54mau； 20.用b通道80%水、d通道20%异丙醇做流动相，流量设为1ml/min，压力波动很大，波动上下10bar，基线一直有波动，不稳定； 21.再次用0.45um滤膜过滤d流动相，加入试剂瓶； 22.用b通道80%水、d通道20%异丙醇做流动相，流量设为1ml/min，压力最后稳定在126bar，基线最后稳定在30mau 23.用b通道80%水、d通道20%异丙醇做流动相，流量设为0.5ml/min，压力波动很大，波动上下10bar，基线一直有波动，不稳定； 24.再次用b通道80%水、d通道20%异丙醇做流动相，流量设为1ml/min，压力波动又变大，波动上下在10890bar，基线再次有波动，不稳定； 25.用b通道80%水、c通道20%异丙醇做流动相，流量设为1ml/min，压力最后稳定在128bar，基线最后稳定在4.5mau 26.用b通道80%水、c通道20%异丙醇做流动相，流量设为0.5ml/min，压力最后稳定在6465bar，基线最后稳定在9mau； 27.再次用b通道80%水、c通道20%异丙醇做流动相，流量设为1ml/min，压力最后稳定在127bar，基线最后稳定在10mau；（4）实验结论：用d通道做流动相不如用c通道做流动相相对稳定，先前d流动相可能混有杂质，泵中单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物的可能性较小，系统中有空气，真空脱气机出现问题和比例阀可能损坏的情况不能确定，需工程师检修。因此每次实验前都要严格过滤各通道流动相，尽量不用d通道。附录3 隔膜真空泵的使用方法及注意事项隔膜真空泵的使用方法1：旋转出真空泵蓝色出气口堵塞。2：检查调压旋转是否处于旋紧状态（与真空压力表相连处）。3：连接减压器，安装滤膜（注意选择有机系与水系），用铁夹固定好。4：接通电源，启动本机电源开关。5：待泵体平稳，用橡胶管衔接好真空泵及减压器，即开始工作。6：停止工作时，关掉真空泵电源，松动调压旋钮至压力为零。7：待减压器内恢复为常压时，再将泵与减压器分离。8：切断电源。注意事项1：本机必须放在干燥、清洁、平整的工作台上且通风良好的地方。2：本机严禁进入任何液体。3：不使用时，应把电线盘绕于机身上并存放于干燥处。4：在通常情况下，真空泵运转工作时，调压旋转应保持处于旋紧状态。减压运转只在特定情况下（如固相萃取）使用。5：在电压不稳时，连续减压，应随时注意观察压力变化。6：工作结束时，将装置置于干燥无尘处。附录4 真空干燥箱操作步骤及注意事项真空干燥箱操作步骤1、将真空泵两个黑帽旋出打开，安装好连接橡胶管的管件；2、将真空干燥箱侧面的导气管用真空橡胶管与真空泵连接；3、将需干燥处理的物品放入真空干燥箱内，箱门关上并将拉手旋紧4、关闭放气阀，开启真空阀。5、接通真空泵电源开始抽气，使箱内真空度达到-0.09-0.1m pa时，关闭真空阀，再关闭真空泵电源。6、把真空干燥箱电源开关拨至“1”处7、 设定温度 按功能键“set”，配合移位键，加键，减键，设定结束按“set”结束，长期保持各项数据至恒温状态。8、根据不同物品潮湿程度，选择不同的干燥时间，如干燥时间较长，真空度下降，需再次抽气恢复真空度，应先开真空泵电源，再开启真空阀。9、干燥结束后应先关闭干燥箱电源，开启放气阀，解除箱内真空状态，再打开箱门取出物品。（解除真空后，如密封圈与玻璃门吸紧变形不易立即打开箱门，经过一段时间后，等密封圈恢复原形后，才能方便开启箱门）注意事项1、 真空箱外壳必须有效接地，以确保使用安全。2、 真空箱不需连续抽气使用时，应先关闭真空阀，再关闭真空泵电源，否则真空泵油要倒灌至箱内。3、 取出被处理物品时，如处理的是易燃物品，必须待温度冷却到低于燃点后，才能放入空气，以免发生氧化反应引起燃烧。4、 真空箱无防爆装置，不得放入易爆物品干燥。5、 真空箱与真空泵之间最好跨过滤器，以防止潮湿体进入真空泵。6、 非必要时，请勿随意拆开边门，以免损坏电器系统。附录5 梅特勒-托利多b-s系列天平一 水平调节b-s/a 系列天平有一水平泡及两只水平调节脚 以弥补称量操作台面细微不平整对称量结果的影响。当水平泡调节至指示器玻璃中央时，天平处于水平位置。方法步骤：调节两只水平调节脚直到水平泡至中央位置1、水平泡在“12点”时 逆时针调节两只调节脚2、水平泡在“3点”时 顺时针调节左调节脚，逆时针调节右调节脚3、水平泡在“6点”时 顺时针调节两只水平调节脚4、水平泡在“9点”时 逆时针调节左调节脚，顺时针调节右调节脚二 开机/关机 1 开机 让秤盘空载并单击on (开机)键。 天平显示自检过程(包括闪现所有字段等)。 当天平回零时，天平就可以称量了。2 关机 按住off （关机）键直到出现“off”字样，松开该键。注：为了获得准确的称量结果，天平必须通电30分钟（ab-s/a分析天平需要60分钟）以获得稳定的工作温度三 简单称量 将样品放在秤盘上，等待直到稳定指示符“” ，消失读取称量结果四 去皮1、将空容器放在天平秤盘上显示其重量值2、去皮 单击键。3、在空容器中加料，显示净重值。如果将容器从天平上移去去皮重量值会以负值显示。去皮重量值一直保留到您再次按键或天平关机五 注意事项1 b-s/a天平仅可在干燥的室内环境中使用2 确保 稳定无振动的安放位置并且越水平越好3 避免阳光直射、 强烈的温度变化、空气对流。最佳的摆放位置：避风的角落、稳定的桌子，尽可能远离房门，窗，散热器以及空调装置的出风口。附录6 吉尔森移液枪移液枪一个完整的移液循环，包括吸头安装容量设定预洗吸头吸液放液卸去吸头等六个步骤。每一个步骤都有需要遵循的操作规范。一、吸头安装：正确的安装方法叫旋转安装法，具体的做法是，把白套筒顶端插入吸头（无论是散装吸头还是盒装吸头都一样），在轻轻用力下压的同时，把手中的移液器按逆时针方向旋转180度。切记用力不能过猛，更不能采取剁吸头的方法来进行安装，因为那样做会对您手中的移液器造成不必要的损伤。二、容量设定：正确的容量设定分为两个步骤，一是粗调，即通过排放按钮将容量值迅速调整至接近自己的预想值；二是细调，当容量值接近自己的预想值以后，应将移液器横置，水平放至自己的眼前，通过调节轮慢慢地将容量值调至预想值，从而避免视觉误差所造成的影响。在容量设定时，还有一个需要特别注意的地方。当我们从大值调整到小值时，刚好就行；但从小值调整到大值时，就需要调超三分之一圈后再返回，这是因为计数器里面有一定的空隙，需要弥补。三、 预洗吸头：在我们安装了新的吸头或增大了容量值以后，应该把需要转移的液体吸取、排放两到三次，这样做是为了让吸头内壁形成一道同质液膜，确保移液工作的精度和准度，使整个移液过程具有极高的重现性。其次，在吸取有机溶剂或高挥发液体时，挥发性气体会在白套筒室内形成负压，从而产生漏液的情况，这时就需要我们预洗四到六次，让白套筒室内的气体达到饱和，负压就会自动消失。四、 吸液：先将移液器排放按钮按至第一停点，再将吸头垂直浸入液面，浸入的深度为：p2、p10小于或等于1毫米，p20、p100、p200小于或等于2毫米，p1000小于或等于3毫米，p5ml、p10ml小于或等于4毫米（浸入过深的话，液压会对吸液的精确度产生一定的影响，当然，具体的浸入深度还应根据盛放液体的容器大小灵活掌握），平稳松开按钮，切记不能过快。五、放液：放液时，吸头紧贴容器壁，先将排放按钮按至第一停点，略作停顿以后，再按至第二停点，这样做可以确保吸头内无残留液体。如果这样操作还有残留液体存在的话，您就应该考虑更换吸头了。六、卸去吸头：卸掉的吸头一定不能和新吸头混放，以免产生交叉污染。英文材料原文hplc quantitation (including trace analysis)one of the strengths of hplc is that it is an excellent quantitative analytical technique . hplc can be used for the quantitation of the primary or a sample (including pure samples),for mixtures of many compounds at intermediate concentrations , and for the assessment of trace impurity concentrations(parts per billion or lower) in a matrix. properly designed, validated, and executed analytical methods should show high levels of both accuracy and precision for a main component analysis(1 to 2% precision and accuracies within 2% of actual values).trace-level quantitation often i