色谱分析法王慧.ppt

色谱分析法,教师: 王 慧 手机:邮箱: ,教学内容及要求,教学内容： 一，色谱法及其分离原理：约6课时 二，气相色谱法（第五章）：约4课时 三，高效液相色谱法（第六章）：约4课时 四，高效液相色谱实验操作练习：约4课时 五，复习：约2课时,教学要求： 1，掌握色谱法分离原理，基本术语，定性和 定量分析方法； 2，熟悉气相、液相色谱仪的基本组成，常用 检测器的检测原理 3，了解色谱理论,教学内容及要求,一 色谱法及其分离原理,第一节：概述 第二节：色谱分离过程和定义 第三节：色谱分离的基本原理 第四节：基本术语 第五节：色谱分离基本理论 第六节：色谱法定性定量分析,本节课重点,了解色谱法的发展及应用,理解并掌握色谱分离过程及原理,准确记忆色谱法的定义和三个基本概念,1, 起源 1903年，俄国植物学家茨维特Tsweet 植物色素分离实验,第一节 概述,茨维特植物色素分离实验,第一节 概述,植物提取液 CaCO3玻璃柱 石油醚淋洗,第一节 概述,实验过程,第一节 概述,2, 发展 1906年，茨维特发表论文首次提出应用吸附原理分离植物色素的新方法命名“色谱法”； 1931年，德国的库恩60余种胡萝卜素的分离1938年诺贝尔化学奖； 1948/1952年诺贝尔化学奖英国的马丁和辛格； 1949年，Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂薄层板薄层色谱法（TLC）推广和应用； 1965年，Giddings将色谱理论继续完善，为日后的色谱发展奠定了理论基础； ,第一节 概述,3, 色谱法在分析化学中的地位和作用 分析对象多为混合物分析鉴定组分和含量必须进行分离色谱法高超的分离能力（显著特点）色谱法成为多种分析方法的先决条件和必需步骤,第一节 概述,表：不同年代各种分析方法应用比例,第一节 概述,表：中国药典中色谱法的应用,第一节 概述,中国药典一、二部所收录药物中，80%以上的鉴别、检查或测定采用色谱法。,固定相,色谱柱,流动相,1, 基本概念,三概念!,第二节 色谱分离过程及定义,固定相：填入柱内静止不动的一相 （分离介质） 色谱柱：装有固定相的柱子 （分离容器） 流动相：自上而下运动的一相 （运载体携待分离组分进入 色谱柱实现分离）,第二节 色谱分离过程及定义,2, 分离过程,王府井 (色谱柱),第二节 色谱分离过程及定义,组分间结构,性质差异,与固定相作用差异,随流动相移动速度不等,差速迁移,色谱分离,第二节 色谱分离过程及定义,第二节 色谱分离过程及定义,A组分: 走过一个颗粒1s;则十个10s, 一百个100s,一万个10000s B组分: 走过一个颗粒1.1s;则十个11s, 一百个110s,一万个11000s ,差异增大分离！,色谱法分离要素: 两相(流动相和固定相) 样品各组分在两相中分配的差异,两要素!,第二节 色谱分离过程及定义,3, 色谱法定义,色谱法（chromatography）/色层法/层析法 是一种物理化学分析方法； 它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别； 当溶质在两相间做相对移动时，各物质在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离。,第二节 色谱分离过程及定义,第二节 色谱分离过程及定义,流 动 相,4, 色谱法分类,第二节 色谱分离过程及定义,高效液相、气相色谱仪,课后思考,影响混合物各组分在两相间分配的 作用力有哪些?,本节课内容,第三节：色谱分离的基本原理 第四节：基本术语,本节课重点,理解分配系数与分配比的意义与区别,掌握色谱曲线及相关术语,学会通过色谱曲线得出相关结论,第三节 色谱分离的基本原理,组分间结构,性质差异,与固定相作用差异,随流动相移动速度不等,差速迁移,色谱分离,第三节 色谱分离的基本原理,当流动相携带混合物流经固定相时，混合物中各组分与固定相发生相互作用。 由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，使得各组分被固定相保留的时间不同，随着流动相的移动，各种组分按一定次序由固定相中先后流出。 与适当的柱后检测方法结合，即可实现混合物中各组分的分离与检测。,分配系数K,第三节 色谱分离的基本原理,组分在固定相和流动相两相间发生的吸附和解吸附、溶解和挥发的过程，叫做分配过程。 在一定温度和压力下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度比，称为分配系数，用 K 表示。,如何衡量组分与固定相相互作用力的大小？,第三节 色谱分离的基本原理,某组分的 K = 0时 组分的分配系数 K 越大，代表组分与固定相作用力越强，越倾向于保留在固定相中。 混合物中不同组分具有不同的分配系数K，是实现混合物中各组分分离的基础。,思考：,第三节 色谱分离的基本原理,在相同固定相条件下，具有不同分配系数 K 值的组分是按照什么顺序先后出峰的？,按分配系数 K 的大小先后出峰：分配系数 K 小的组分在色谱柱中保留时间短，先出峰；分配系数 K 大的组分在色谱柱中保留时间长，后出峰！,思考：,第三节 色谱分离的基本原理,每个组份在各种固定相上的分配系数 K 是不同的，当两种组分在某一固定相中无法分离时，改用其它适宜的固定相可改善分离效果。,试样中的各组分具有不同的 K 值是分离的基础，如果两种组分 K 值完全相同，能否分离？怎么办？,当两相作相对运动时，试样中的各组分就在两相中进行反复多次的分配，使得原来分配系数只有微小差异的各组分产生很大的分离效果，即实现差速迁移，达到分离的目的。所以，可以认为： 色谱法是利用不同的物质具有不同的K值而进行分离的。,第三节 色谱分离的基本原理,第四节 基本术语,1，色谱图和色谱峰,色谱图： 试样中各组分经色谱柱分离后，随流动相依次进入检测器，将各组分浓度变化转为电信号，在记录仪上记录为检测器响应信号随时间变化的曲线，即色谱流出曲线。,第四节 基本术语,第四节 基本术语,色谱峰：色谱柱流出组分流经检测器时，检测器对其响应信号随时间变化所形成的峰形曲线。,高斯分布！,2，基线,第四节 基本术语,柱中仅有流动相（无试样）通过时，检测器响应讯号的记录值即为基线。 基线反映了在实验操作条件下，检测系统噪声随时间变化的情况。稳定的基线应该是一条水平直线。,第四节 基本术语,基线漂移：指基线随时间定向地缓慢变化。 （仪器不稳定造成的）,第四节 基本术语,基线噪声：指由各种因素所引起的基线起伏。 （仪器本身所固有的，以噪音带表 示，仪器越好，噪音越小）,3，色谱峰高,第四节 基本术语,色谱峰顶点与基线之间垂直距离以 h 表示。,4，色谱峰区域宽度,第四节 基本术语,区域宽度是组分在色谱柱中谱带扩张的函数，用以衡量色谱柱的分离效能，通常区域宽度越窄越好。度量色谱峰区域宽度通常有三种方法。,第四节 基本术语,标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。 半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度 Y1/2 = 2.354。 峰底宽(Y)：4。色谱峰两侧的转折点所作切线在基线上的截距。,第四节 基本术语,标准偏差()：又称为色谱峰的展宽，表示数据离散程度。 越大峰越胖，数据越离散； 越小峰越瘦，数据越集中。,5，保留值,第四节 基本术语,表示试样中各组分在色谱柱内停（滞）留的时间或将组分带出色谱柱所需流动相的体积。 是各组分在色谱柱中保留行为的量度，反映组分与固定相作用力的大小。 通常用保留时间、保留体积来表示。 保留值能揭示色谱过程作用机理及分子结构特征，是色谱定性分析和色谱过程热力学特性的重要参数。,1，用时间表示的保留值,第四节 基本术语,死时间 (tM )： Mobile Phase Time 流动相通过色谱柱及管路所需要的时间。 试样在色谱柱和管路死体积中的滞留时间。 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到色谱图上出现峰极大值所需的时间。,第四节 基本术语,保留时间 (tR): Retention Time 试样通过色谱柱及管路所需要的时间。 试样到达柱末端的检测器所需要的时间。 试样从进样开始到柱后出现峰极大值时所经历的时间。,色谱定性的依据！,第四节 基本术语,调整保留时间 (tR ): Adjusted Retention Time 组分在固定相中滞留所需的时间。,组分随流动相通过柱子及管路死体积所需的时间tM,组分在固定相中滞留所需的时间tR,组分通过色谱柱及管路的保留时间tR,tR = tR - tM,第四节 基本术语,tR,tM,tR,2，用体积表示的保留值,第四节 基本术语,死体积 (VM )： Mobile Phase Volume 流动相通过柱子至检测器所消耗的体积 色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。,第四节 基本术语,保留体积 (VR): Retention Volume 组分通过柱子到检测器所消耗的流动相体积。 组分从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。 调整保留体积 (VR ): Adjusted Retention Volume 组分在固定相中滞留所消耗的流动相体积 VR = VR - VM,第四节 基本术语,时间保留值与体积保留值间关系 VM ：指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。 Fc：流动相体积流速（mL/min） VM = tM Fc VR = tR Fc VR = tR Fc,第四节 基本术语,3，相对保留值（对多个组分而言）,某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比,第四节 基本术语,只与柱温和固定相性质有关，与流动相流速等色谱条件无关，色谱定性分析的重要参数之一。 可用于表示色谱柱的选择性：r2,1 越大，表明两组分 tR 相差越大，越容易实现分离。,第四节 基本术语,6，分离度R,柱效：色谱柱分离效能。色谱峰高且窄则柱效高，色谱峰矮且胖则柱效低。 选择性：色谱法中，常用色谱图上两峰间的距离衡量色谱柱的选择性，其距离越大说明柱子的选择性越好。相对保留值 r2,1可用于表示色谱柱的选择性。,第四节 基本术语,色谱分离中的四种典型情况,a 分离效果差，柱效低，选择性低 b 基本上完全分离，柱效高，峰窄，选择性低 ； c 完全分离，选择性增加，柱效低，峰宽 d 完全分离，柱效高，选择性好,a,b,c,d,第四节 基本术语,分离度（resolution, R）： 同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标。也称总分离效能指标或分辨率。 定义：,第四节 基本术语,相邻两组分保留值(tR2-tR1)差别越大, 平均峰底宽度1/2(Y2+Y1)越小， 则R值越大，两组分分离得越好。,规定：R 1.5，以保证相邻两峰完全分离！ R可作为色谱柱总的分离效能指标。 注意：R越大，分离效果越好， 但会延长分析时间。,第四节 基本术语,7，分配比k 又叫容量因子、容量比。指在一定的柱温和柱压下，组分在两相之间分配达到平衡时，组分分配在在固定相和流动相中物质的量比（或质量比），即：,第四节 基本术语,分配系数K与分配比k的关系,Cs，Cm分别为组分在固定相和流动相的浓度； Vm为柱中流动相的体积，近似等于死体积； Vs为柱中固定相的体积； 称为相比率，反映各种色谱柱型及其结构的重要特性。,第四节 基本术语,分配系数K与分配比k的关系,K和k都与组分及固定相的热力学性质有关，并随柱温、柱压的变化而变化； K是组分在两相中浓度之比， k是组分在两相中分配总量之比； K只取决于组分和两相性质，与两相体积无关， k还与固定相的量而改变； k可以方便地由色谱流出曲线得到，故更为常用，但都可用于描述色谱分离。,第四节 基本术语结论,根据色谱峰数目，可判断试样中所含组分的最少个数。 根据色谱峰保留值，可以进行定性分析。 根据色谱峰高或峰面积，可以进行定量分析。 根据色谱峰间距及其宽度，可以对色谱柱的分离效能进行评价。,色谱流出曲线提供的重要信息,第四节 基本术语结论,首要条件：相邻两组分的保留值存在一定差别，两组分的色谱峰间距足够远。 第二条件：色谱峰区域宽度要窄。区域宽度与组分在流动相和固定相中连续分配过程的分子扩散、传质等因素有关，是色谱动力学的研究课题。,色谱分离的条件,第四节 基本术语结论,A,B,C,D,第五节 色谱分离基本理论,试样在色谱柱中分离过程包括：,各组分在两相间的分配情况塔板理论 各组分在色谱柱中的运动情况速率理论,了解!,第五节 色谱分离基本理论,1，塔板理论,假想：色谱柱为一个精馏塔，塔内有一系列连续、相等体积塔板，每一塔板理论高度为 H。 假设：在每一块塔板上，被分离组分在气液两相间瞬时达到一次分配平衡，然后随载气从一块塔板向下一块塔板以脉动式迁移。,第五节 色谱分离基本理论,多次分配平衡后，K小的组分先离开精馏塔，K大的组分后离开精馏塔，不同K值组分分离。,第五节 色谱分离基本理论,理论塔板数n：可以认为是组分在柱中的平衡次数/分配次数。用以描述色谱柱分离效能。 取决于固定相和流动相自身性质。 一般情况下，n1000。 n 越大，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。,第五节 色谱分离基本理论,2，速率理论动力学理论,涡流扩散项A 分子扩散项B 传质扩散项C,H = A + B/u + Cu H - 理论塔板高度；u - 载气的线速度(cm/s),第五节 色谱分离基本理论,涡流扩散项A,组分随载气迁徙时，受填充物颗粒阻碍（大小及填充不均匀）而改变流动方向，形成紊乱的类似“涡流”的流动，同一组分运行路线长短不同，流出时间不同，使色谱峰展宽。,第五节 色谱分离基本理论,使用细颗粒的固定相并填充均匀可减小A，提高柱效。,第五节 色谱分离基本理论,分子扩散项B,纵向分子扩散是由于浓度梯度引起的。 当样品被注入色谱柱时，它呈塞子状分布。随着流动相的推进，塞子因浓度梯度而向前后自发地扩散，使组分分子在色谱柱轴向上产生浓差扩散，其方向是沿柱纵向扩散，色谱峰变宽。,第五节 色谱分离基本理论,传质阻力项C,物质系统由于浓度不均匀而发生物质迁移过程，称为传质。影响这个过程进行速度的阻力，叫传质阻力。 因传质阻力的存在，使分配不能瞬间达到平衡，使分子具有滞留倾向，在此过程中，部分组分分子随流动相向前运动，发生分子超前，引起色谱峰展宽。,第六节 色谱法定性定量分析,色谱峰保留时间定性分析 色谱峰高或峰面积定量分析,参考书：P159,将待测组分与基质分离，用溶剂提取等方法除去干扰杂质。,1，试样的预处理,第六节 色谱法定性定量分析,第六节 色谱法定性定量分析,实际样品：,无色、无味； 多为有机物； 含量很低。,分析对象：,组成复杂； 形态多样； 基质含量高，干扰严重。,样品：,第六节 色谱法定性定量分析,2，色谱定性分析确定每个色谱峰所代表的化合物,主要依据是每个组分的保留值； 一般需要标准样品，利用纯组分样品对照的方式定性； 对某一未知试样，单独用色谱法定性十分困难，因此常需与化学分析及其它仪器分析方法相结合。,第六节 色谱法定性定量分析,1，利用色谱保留值定性 利用绝对保留值定性,在一定的固定相和恒定的操作条件下，每种物质都有一定的保留值，一般不受其它组分影响。故可利用已知物的保留值和未知物的保留值对照进行定性。 方法：待测组分色谱峰与纯物质色谱峰比较。 条件：此法针对已知或简单组分样品；并要求严格控制色谱操作条件，保证重现性。,第六节 色谱法定性定量分析, 利用相对保留值定性（文献保留值）,利用r2,1作定性分析，它仅与柱温和固定相性质有关，可消除某些操作条件差异所带来的影响 。 方法：采用基准物质与待测样品混合进样，测得r2,1，对比色谱手册中与之对应的标准物质及已知纯物质在相同条件下的r2,1值。 条件：组分较简单的已知范围的混合物试样,第六节 色谱法定性定量分析,练习,第六节 色谱法定性定量分析,将标准物质加入试样中，比较前后色谱图，找峰高明显增加的色谱峰。 方法：首先用被测试样作色谱图，然后将已知纯物质加到试样中，在相同条件下作色谱图，对比。 条件：试样组分较复杂，峰间距离太近，难以准确测定其保留值时，采用此法定性。,2，峰高增量定性：,第六节 色谱法定性定量分析,采用极性差别较大的两种不同色谱柱进行分离，观察保留时间是否均相同。 方法：将试样和标准物的混合物分别在两根极性相差较大的色谱柱上进行色谱分离，观察两色谱峰是否始终重合。 目的：避免不同组分由于保留值的偶然一致性，可能发生的定性错误,3，双色谱系统定性：,第六节 色谱法定性定量分析,3，色谱定量分析 1 定量依据和校正因子,在一定的操作条件下，被测组分质量与其色谱峰面积（或峰高）成正比。即,mi = fi Ai,比例常数：组分 i 的定量校正因子,组分 i 色谱峰面积,第六节 色谱法定性定量分析,绝对校正因子 fi ：指单位峰面积所代表组分的质量，随色谱条件而变化，由仪器灵敏度决定。 相对校正因子 fi ：某组分 i 的绝对校正因子与基准物质 s 的绝对校正因子之比，不受色谱条件影响。（数值可查）,第六节 色谱法定性定量分析,2 定量方法, 归一化法 ：若试样中有n个组分，均能出色谱峰，则其中某组分 i 的质量分数。,优点：无需标样，简便、准确、操作条件对结果影响较小，易于分析多种组分中各组分的含量。 缺点：试样中组分必须全部出峰，且检测器对所有组分均有响应信号，不适用于微量组分的含量测定。,第六节 色谱法定性定量分析, 外标法 A 标准曲线法：用待测组分的纯物质来制作标准曲线。步骤如下： a:配成一系列不同浓度的标准溶液(浓度已知); b:一定条件下，分别定量进样测定（得峰面积）; c:绘制峰面积对标液浓度的标准曲线； d:在相同条件下，注入相同体积的被测试样; e:所测得的峰面积，在标准曲线上求出被测组分 的含量。,举例,ng/mL,第六节 色谱法定性定量分析, 外标法 B 外标一点法:外标一点法是用一种浓度的对照品溶液对比测定样品溶液中i组分的含量。 将对照品溶液与样品溶液在相同条件下多次进样，测得峰面积的平均值，用下式计算样品中i组分的量：,C 外标两点法 用不同浓度的标准品进样两次，然后根据两点确定一条直线算出斜率。供试品的进样浓度处在标品浓度之间，根据斜率相等算出浓度。 为工作曲线法的替代方法。,第六节 色谱法定性定量分析,第六节 色谱法定性定量分析,外标法优缺点:,优点：简单，不需要校正因子，不论样品中其它组分是否出峰，均可对待测组分定量。 缺点：准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。 适用性： 适于大批量样品的快速分析。,第六节 色谱法定性定量分析, 内标法 在一定量试样中加入一定量内标物，根据被测试样和内标物的质量之比（或浓度之比C样/C内）及相应的色谱峰面积之比（A样/A内），计算被测组分含量。,第六节 色谱法定性定量分析,内标法加校正因子,第六节 色谱法定性定量分析,内标法标准曲线法,第六节 色谱法定性定量分析,内标物要求:,内标物应是该试样中不存在的纯物质； 必须完全溶于试样中，并与试样中各组分的色谱峰能完全分离； 加入内标物的量应接近于被测组分； 色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近，或在几个被测组分色谱峰中间。,第六节 色谱法定性定量分析,3 外标法与内标法比较,第六节 色谱法定性定量分析,第六节 色谱法定性定量分析,第六节 色谱法定性定量分析,补充知识点：,拖尾因子(tailing factor，T) 用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子或不对称因子。 中国药典规定T应为0.95-1.05。T0.95为前延峰，T1.05为拖尾峰。 分析中，一般认为T=0.9-1.3为合格。,不对称度,知识点复习,1，基本概念,固定相,色谱柱,流动相,三概念!,知识点复习,2，色谱分离过程及原理,组分间结构,性质差异,与固定相作用差异,随流动相移动速度不等,差速迁移,色谱分离,知识点复习,色谱法分离要素: 两相(流动相和固定相) 样品各组分在两相中分配的差异,两要素!,知识点复习,3，色谱法定义,色谱法（chromatography）/色层法/层析法 是一种物理化学分析方法； 它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别； 当溶质在两相间做相对移动时，各物质在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离。,知识点复习,4，色谱参数及术语参数,分配系数 分配比 二者用于衡量组分与固定相相互作用力的大小，描述色谱分离，是组分得以分离的基础； k可以方便地由色谱流出曲线得到，更为常用。,知识点复习,4，色谱参数及术语术语,色谱图和色谱峰 基线 色谱峰高，峰面积（h, A） 色谱峰区域宽度（ 展宽，Y1/2，Y ） 保留值（tM tR tR ; VM VR VR ; Fc ; 2,1） 分离度（R）,tR,tM,tR,知识点复习,h,Y1/2,Y,知识点复习,(tR2-tR1),(Y1+Y2),分离度R：同时反映色谱柱效能和选择性。,知识点复习,5，色谱流出曲线提供的重要信息,根据色谱峰数目组分最少个数。 根据色谱峰保留值定性分析。 根据色谱峰高或峰面积定量分析。 根据色谱峰间距及其宽度分离度 分离效能评价。,知识点复习,6，色谱分离理论,塔板理论理论塔板数n认为是组分在两相间分配的次数n1000 速率理论,涡流扩散项A固定相填充不均匀引起的不同路径扩散 分子扩散项B分子轴向扩散引起浓度差，导致展宽 传质阻力项C组分在两相间传质的阻力阻碍快速平衡,H = A + B/u + Cu H - 理论塔板高度；u - 载气的线速度(cm/s),知识点复习,7，色谱定性和定量分析定性分析,保留值定性 峰高增量定性样品中加入A纯品峰高也增加的即为A物质 双色谱系统定性判断在性质差别较大的两个色谱系统下是否有相同色谱行为,绝对保留值tR 相对保留值2,1,知识点复习,7，色谱定性和定量分析定量分析,定量依据：在一定的操作条件下，被测组分质量m与其色谱峰面积A（或峰高）成正比。即： 定量方法,mi = fi Ai,归一化法所有组分均能出峰 外标法 内标法,练习题,1，色谱图上一个色谱峰的正确描述是( ) A、代表所有未分离组分 B、仅代表检测信号变化 C、可能代表一种或一种以上组分 D、仅代表一种组分 2，下列保留参数中完全体现色谱柱固定相对组分滞留 作用的是( ) A、死时间 B、保留时间 C、调整保留时间 D、相对保留时间 3，色谱保留参数“死时间”的正确含义是( ) A、流动相流经色谱柱所需时间 B、所有组分流经色谱柱及管路所需时间 C、待测组分流经色谱柱所需时间 D、完全不与固定相作用组分流经色谱柱及管路所需时间,练习题,4、色谱峰的区域宽度用于色谱柱效能的评价，下列参数不属于区域宽度的是( ) A、 B、Y1/2 C、Y D、tR 5、可用做定量分析依据的色谱图参数是( ) A、A B、h C、Y D、tR 6、 塔板理论对色谱分析的贡献是( ) A、提出了色谱柱效能指标 B、解释了色谱峰的分布形状 C、给出了选择分离条件的依据 D、解释了色谱峰变形扩展原因 7、下列保留参数中不能用做定性分析依据的是( ) A、死时间 B、保留时间 C、调整保留时间 D、相对保留时间,练习题,8、在实际色谱分析时常采用相对保留值作定性分析依据，其优点是( ) A、相对保留值没有单位 B、相对保留值数值较小 C、相对保留值不受操作条件影响 D、相对保留值容易得到 9、使用归一化法作色谱定量分析的基本要求是（） A、样品中各组分均应出峰或样品中不出峰的组分的含量已知 B、样品中各组分均应在线性范围内 C、样品达到完全分离 D