基因工程与PCR.ppt

生物化学CAI课件A,第13章 基因工程与PCR,作者高新旺祁新芝,河南省周口卫校,目录,学习目标,PCR技术,复习题,重点内容：基因工程,基因工程,学 习 目 标,1.说出基因工程的操作步骤 2.列出基因工程的主要工具酶 3.简述PCR技术的工作原理 4.列出PCR的操作步骤 学时分配 第一节 2学时 第二节 1学时,第一节 基因工程,基因工程又称重组DNA技术，是对携带遗 传信息的分子进行设计和改造的分子工程，包 括基因重组、克隆和表达。基因工程与蛋白质 工程、酶工程和细胞工程共同构成了当代新兴 的学科领域生物技术工程。,一、基因工程的相关概念,（一）DNA克隆 所谓克隆(clone)就是来自同一始祖的 相同拷贝(copy)的的集合；获取同一拷贝的 过程称为克隆化，也就是无性繁殖。通过无 性繁殖过程获得的“克隆”，可以是分子的， 也可以是细胞的，动物的或植物的。在分子 遗传学领域所谓的分子克隆专指DNA的克 隆。,DNA克隆就是应用酶学的方法，在体外将各种来 源的遗传物质同源的或异源的、原核的或真核的、 天然的或人工的DNA与载体DNA结合成一具有自我复 制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转 化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细 胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，既 DNA克隆。由于早期研究是从较的染色体分离、扩增 特异性基因，因此DNA克隆又称基因克隆(gene cloning)。 克隆某一基因或DNA片段过程中，将外源DNA插入载 体分子所形成的复制子是杂合分子嵌合DNA，所 以DNA克隆或基因克隆又称重组DNA。 实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称重 组DNA技术，又称基因工程。,（二）工具酶 在重组DNA技术中，常需要一些工具酶进行基因操作。 1限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶能识别特异的DNA序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA分子。限制性核酸内切酶存在于细菌体内，种类很多。目前发现的限制性核酸内切酶有1800种以上，常用的有几十种。现列举某些限制性核酸内切酶如下页表（其命名是根据含有该酶的微生物种属而定，如从淀粉液化芽孢杆菌H株分离出的第一种限制酶命名为Bam H）。,下表：限制性核酸内切酶,续表：限制性核酸内切酶,2DNA连接酶 DNA连接酶催化DNA分子中相邻的5磷酸基和3羟基末段之间形成磷酸二酯键 ，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片连接。 3 DNA聚合酶 其作用是：合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3末端 4Klenow片段 又名DNA聚合酶大片段，具有完整的DNA聚合酶的 5 3聚合、 3 5外切活性，。常用cDNA于的合成，双链DNA 3末端标记等 5反转录酶 其作用是： 合成cDNA 替代DNA聚合酶进行填补、标记或DNA序列分析 6多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化或 标记探针 7末端转移酶 在3羟基末端进行同质多聚物加尾 8碱性磷酸酶 切除末端磷酸基,（三）目的基因 应用重组DNA技术的目的是为获得某一感兴趣 的基因或DNA序列，或是为获得感兴趣基因的表达 产物蛋白质。这些感兴趣的基因或DNA序列就是 目的基因，又称目的DNA。目的基因有两种类型， 即cDNA和基因组DNA。 cDNA是指经反转录合成的 与RNA（通常指mRNA或病毒RNA）互补的单链 DNA。以单链cDNA为模板经聚合反应可合成双链 cDNA。基因组DNA是指代表一个细胞或生物体整 套遗传信息（然色体及线粒体）的所有DNA序列。 目的基因又称外源DNA。,（四）基因载体 基因载体或称克隆载体，是为携带感 兴趣的目的基因、实现目的基因的无性繁 殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些 DNA分子。可充当基因载体的DNA分子有 质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA。它们 经适当改造后仍具有自我复制能力，或兼 有表达外源基因的能力。,所谓质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双 链DNA分子,小的23kb，大的可达数百kb。质粒分 子本身是含有复制功能的遗传结构，能在宿主细胞 内独立自主的进行复制，并在细胞分裂时保持恒定 地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息，所以会 赋予宿主细胞一些遗传性状，如对青霉素或重金属 的抗性等。根据质粒赋予细菌的表型可识别质粒的 存在，是筛选转化子细菌的根据。因此，质粒DNA 的自我复制功能及所携带的遗传信息在重组DNA操 作，如扩增、筛选过程中都是极为有用的。,pBR322质粒是稍早构建的质粒载体，其 DNA分子中含有单个EcoR限制性内切核酸酶 位点，可在此插入外源基因。此外还含有 ter 和 amp两个抗药基因（分别为抗四环 素抗氨苄青霉素） 。这个质粒还含有一个复 制起始点（ori）及DNA复制调节有关的序 列，赋予pBR322质粒复制子特性（见下页图 示）。 常用作克隆载体的噬菌体DNA有噬菌 体和M13噬菌体。,pBR322质粒,二、重组DNA技术基本原理及操作步骤,一个完整的DNA克隆过程应包括：目的基因的获取，基因载体的构建，目的基因与载体的拼接，重组DNA分子导入受体细胞，筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）。以质粒为载体的DNA克隆过程如下页图所示：,下图：以质粒为载体的DNA克隆过程,（一）目的基因的获取 1化学合成法 如果已知某种基因的核苷酸序列可以利用DNA合成仪通过化学合成法合成目的基因。 2基因组 DNA文库 分离细胞染色体DNA，利用限制性内切核酸酶将染色体DNA切割成基因水平的许多片段，其中即含有我们感兴趣的基因片段。将它们与适当的克隆载体拼接成重组DNA分子，继而转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。不同细菌所包含的重组DNA分子内可能存在不同的染色体DNA片段，这样生长的全部细菌所携带的各种染色体DNA片段就代表了整个基因组。存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称基因组 DNA文库。基因组 DNA文库就像图书馆库存万卷书一样，涵盖了基因组全部基因信息，也包括我们感兴趣的基因。建立基因组 文库后需结合适当筛选方法从众多转化子菌落中选出含有某一基因的菌落，在行扩增，将重组DNA分离、回收，获得目的基因的无 性繁殖克隆（见下页图）。,上图:基因组DNA文库的构建,3 cDNA文库 以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA（cDNA），再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库（见下页图示）。由mRNA制作的cDNA文库包含了细胞表达的各种mRNA信息，自然也含有我们感兴趣的编码cDNA 。然后，采用适当方法从cDNA文库中筛选出目的cDNA 。当前发现的大多数蛋白质的编码基因几乎都是这样分离的。,上图：构建cDNA文库示意图,4聚合酶链反应 目前，已广泛采用聚合酶链反应（PCR）获取目的DNA。PCR是一种在体外利用酶促反应获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术（见本章第二节）,（二）克隆载体的构建 外源DNA片段离开染色体是不能复制 的。将外源DNA连接到复制子上，外源DNA 则可作为复制子的一部分在受体细胞中复 制，这种复制子就是克隆载体。 （三）目的基因与载体的连接 用DNA连接酶将上述目的基因与克隆载 体连接在一起，即构成重组体分子。 其连接方式有如下几种：,1粘性末端连接 同一限制性酶切位点连接 ：由同一限制性内 切核酸酶切割的不同DNA片段具有完全性同的末 端。只要酶切后产生单链突出（5突出及3突出）的 粘性末端，如：,同时酶切位点附近的DNA序列不影响连 接，那么，当两个DNA片段一起退火时，粘 性末端单链间进行碱基配对，然后在DNA连 接酶催化下形成重组 DNA分子。 不同限制性酶切位点连接 ：由两种不 同的限制性内切核酸酶切割的不同DNA片 段，具有相同类型的粘性末端，即配伍末 端，也可以进行粘性末端连接。,2平端连接DNA连接酶可催化相同和不相同限制 性核酸内切酶切割的平端之间的连接。 3 同聚物加尾连接 同聚物加尾连接 是利用同 聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连 接。在末端转移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚 物序列、制造出粘性末端，而后进行粘性末端连接。 这是一种人工提高连接效率的方法，属于粘性末端连 接的一种特殊形式。 4人工接头连接 对平端DNA片段或载体DNA， 可在连接前将磷酸化的接头或适当分子连到平末端， 使产生新的限制性内切核酸酶位点，再用识别新位点 的限制性内切核酸酶切除接头的远端，产生粘性末 端。这也是粘性末端连接的一种特殊形式。,（四）重组DNA导入受体菌 外源DNA（含目的DNA ）与载体在体外连接成重组DNA分子（嵌合DNA ）后，需将起导入受体菌。随受体菌生长、增殖，重组DNA分子得以复制、扩增，这一过程即为无性繁殖；筛选出的含目的DNA的重组体分子即为一无性繁殖系或克隆。进行无性繁殖时所采用的受体菌多为从大肠杆菌K-12改造的安全宿主菌，在人的肠道无存活率或存活率极低。在选择适当的受体菌后，进行理化方法处理，使宿主细胞处于最适摄取和容忍重组体的状态，即成感受态细胞。根据重组DNA时所采用的载体性质不同，导入重组DNA分子有转化、转染和感染等不同方式。,（五）重组体的筛选 通过转化，重组体DNA分子被导入受体 细胞，经适当涂布的培养基得到大量转化子 菌落。因为每一重组体质携带某一段外源基 因，而转化时每一受体菌又只能接受一个重 组体分子，所以设法将众多的转化菌落区分 开来，并鉴定哪一菌落所含的重组DNA分子 确实带有目的基因，即可得到目的基因的克 隆，这一过程即为筛选或选择（选择方法 略） 。,（六）克隆基因的表达 经上述过程分离获得特异序列的基因组DNA或 cDNA克隆，即基因克隆，这是进行重组DNA技术操作 的基本目的之一。此外，采用重组DNA技术还可进行目 的基因的表达，实现生命科学研究、医药或商业目的， 亦即基因工程的最终目标。它涉及正确的基因转录、 mRNA翻译及适当的转录后、翻译后加工过程。这些过 程的进行在不同的表达体系是不一样的，这些差别不但 与基因的来源、性质有关，而且与载体和表达体系有 关。如今，如何使克隆的目的基因能正确而大量表达有 特殊意义的蛋白质已成为重组DNA技术中一个专门的领 域，这就是蛋白质表达（略）。,第二节 PCR技术,PCR(polymerase chain reaction) 的中文全 称为聚合酶链反应，这是一种对特定DNA片段进行体 快速扩增的技术，发明于1985年。应用这一技术可将 微量的DNA片段扩增一百万倍以上。PCR反应理论的 提出和技术上的完善对与分子生物 学的发展具有不可 估量的价值。它以敏感度高、特 异性强、产率高、重 复性好以及快速简便等优点迅 速成为分子生物学研究 中应用最为广泛的方法，并 使得很多以往无法解决的 分子生物学研究难题得以解决。发明这一技术的 K. Mullis也因此贡献获得了1993年度诺贝尔化学奖。,一、PCR技术的工作原理,PCR的基本工作原理是以拟扩增的DNA分子 为模板，以一对分别与模板5末 端和3末端互补的 寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按 照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的 DNA合成，重复这一过程，即可使目的片段得到扩 增（见下页图示）。 组成PCR反应体系的基本成分包括： 模板 DNA、特异性引物、耐热性DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）、dNTP以及含有Mg2+的缓冲液。,PCR的基本反应步骤包括：变性，将反应体系加热至95，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除；退火，将温度下降至 5055使引物与模板DNA结合；延伸，将温度升至72， DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。上述三个步骤称为一个循环（见下页图示） ，新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环（2530次）后即可达到扩增DNA片段的目的。 （PCR循环仪见下页图）,PCR 循环仪,2004年8月摄于北大医学部生化楼 作者,2退火 （引物与单链DNA结合）,3聚合延伸 （合成新的双链DNA）,1热变性 （双链DNA解链）,上图：PCR循环图,二、 PCR技术的主要用途,（一）目的基因的克隆 PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供 了简便快速的方法。该技术可用于：与反转录反应相结 合，直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片段；利用 特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知的目的基 因片段；利用兼并引物从cDNA文库或基因组文库中获得 具有一定序列相似性的基因片段；利用随机引物从cDNA 文库或基因组文库中克隆基因。 （二）基因的体外突变 在PCR技术建立以前，在体外对基因进行各种突变是一费时费力的工作。现在，利用PCR技术可以随意设计在体外对目的基因进行嵌和、缺失、点突变等改造。,（三）DNA和RNA微量分析 PCR技术高度敏感，对模板DNA的含量要求 很低，是DNA和RNA（RNA需要先反转录成为cDNA）微量分析的最好方法。理论上讲，只要 存在 1 分子的模板，就可以获得目的片段。实际工 作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足 PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔 的应用前景。 （四）DNA序列测定 将PCR技术引入序列测定，使测序工作大为