食品中金黄色葡萄球菌污染状况研究.pdf

表1样品类别及份数 T a b l e1 T h ec a t e g o r ya n dt h en u m b e ro f t h es a m p l e s 类别生牛乳生鲜肉肉制品水产品速冻食品果蔬豆制品总计 数量/份6 02 0 05 05 05 05 05 05 1 0 世界卫生组织(WH O) 曾公告, 食源性疾病和 食品污染已成为世界性公共卫生问题。每年发生 的食源性疾病近数十亿例,发达国家每年至少有 三分之一的人群患食源性疾病,其中约有1 7 0万 1 5岁以下儿童因食源性微生物污染引起腹泻而 死亡 1 。 金黄色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u sa u r e u s, 简称 金葡菌)是引起细菌性食物中毒的重要病原菌之 一。 无论在发达国家还是在发展中国家, 由金葡菌 引起的食物中毒在细菌性食物中毒中占有较大比 例。 该菌在自然界中分布广泛, 在人体中主要存在 于皮肤、 粘膜, 特别是鼻咽部,3 0 % 8 0 %的人群为 该病原菌的携带者 2 , 因此金葡菌污染食品的几 率较大。在美国, 大约每年超过1 8 5 0 0 0人发生金 黄色葡萄球菌食物中毒, 其中约1 7 5 0人住院, 每 年损失约1 5亿美元;在欧盟,1 9 9 3 1 9 9 8年报告 的金黄色葡萄球菌食物中毒共9 2 6起,占食源性 疾病的4 . 5 % 3 。日本的调查结果表明, 平均3 2 . 5 % 的食品存在金葡菌的污染 4 。 据美国C D C报告, 金 黄色葡萄球菌引起的食物中毒仅次于大肠埃希 菌, 居第2位, 占细菌性食物中毒的3 3 %。加拿大 金葡萄的发生率更高, 占细菌性食物中毒的4 5 % 5 , 其引起的食物中毒也已成为世界性的公共卫生问 题 6 。近年来, 我国每年由金葡菌引起的食物中毒 事件已居第4位 7 。 鉴于此, 采集7种食品样品, 分离、 鉴定其中 污染的金黄色葡萄球菌,探讨该菌在食品中的污 染状况, 为预防由其引起的食源性疾病的暴发、 流 行及追踪污染源提供依据。 1材料和方法 1 . 1样品来源 2 0 0 6年7月到2 0 0 7年7月共采集样品5 1 0 份。除生鲜牛乳6 0份样品采自保定市市郊奶户 外,其余4 5 0种样品均采自保定各超市及农贸市 场。样品分类见表1。 食品中金黄色葡萄球菌污染状况研究 索玉娟于宏伟凌巍贾英民 ( 河北农业大学食品科技学院保定0 7 1 0 0 1) 摘要对采集的生牛乳、 生鲜肉( 猪肉、 牛肉、 羊肉、 鸡肉) 、 肉制品、 水产品、 速冻食品、 果蔬、 豆制品等5 1 0份样 品进行金黄色葡萄球菌的分离与鉴定, 为金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的监测以及追踪污染源提供依据。共 检出被金黄色葡萄球菌污染的食品1 0 8份, 总检出率为2 1 . 2 %, 且各类样品的受污染程度存在明显差异。 关键词食源性疾病金黄色葡萄球菌污染 文章编号1 0 0 9 - 7 8 4 8(2 0 0 8)0 3 - 0 0 8 8 - 0 6 收稿日期:2 0 0 7 - 0 8 - 2 0 作者简介:索玉娟, 女,1 9 8 1年出生, 硕士生 通讯作者:贾英民 1 . 2主要仪器与设备 高速冷冻离心机5 4 1 7 R,上海安亭科学仪器 厂; 电子恒温水浴锅H H . S Y 1 1 - N i, 北京市光明医 疗仪器厂;T G r a d i e n tT h e r m o c y c l e r9 6型P C R仪, V o l . 8 N o . 3 J u n .2008J o u r n a l o f C h i n e s eI n s t i t u t eo f F o o dS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y 中 国 食 品 学 报 第8卷第3期 2008年6月 第8卷 第3期 德国B i o m e t r a公司;D Y C p - 3 2型电泳槽,北京市 六一仪器厂;F A 1 0 0 4电子天平, 上海天平仪器厂; D Y Y - 8 B型稳压稳流电泳仪, 北京市六一仪器厂; B T S - 2 0 M型凝胶成像系统, 德国U V I T E C公司。 1 . 3培养基 胰酪胨大豆肉汤、7 . 5 %氯化钠肉汤、 血琼脂平 板、B a i r d - P a r k e r琼脂平板、肉浸液肉汤、灭菌盐 水、 兔血浆均为本试验室自制。 1 . 4标准菌株 金黄色葡萄球菌A T C C 1 3 5 6 5、A T C C 2 5 9 2 3均 购自中国普通微生物菌种保藏中心。 1 . 5分离鉴定方法 1 . 5 . 1金 葡 菌 的 分 离 鉴 定按 照G B 4 7 8 9 . 1 0 - 2 0 0 3进行。 1 . 5 . 2 P C R方法验证由于一些非金葡菌菌株可 能产生大量的活性很高的蛋白酶 ( 假凝固酶) , 导 致假阳性 8 , 所以采用P C R扩增耐热核酸酶(n u c) 基因的方法对所获菌株进行验证。n u c基因为金 黄色葡萄球菌D N A片断高度保守序列 9 , 该基因 编码金黄色葡萄球菌耐热核酸酶 1 0 , 是金黄色葡 萄球菌所特有的 1 1 。 引物由上海生工生物科技有限公司合成。P C R扩增程序:9 4预变性4m i n,9 4 1m i n 5 8 0 . 5 m i n 7 2 1 . 5 m i n,3 0个循环,最后7 2 延伸3 . 5 m i n。 2结果与分析 2 . 1鉴定结果与分析 5 1 0份样品经增菌、 分离培养、 革兰氏染色镜 检后得到疑似金黄色葡萄球菌的菌株,经血浆凝 固酶试验和P C R扩增耐热核酸酶鉴定 ( 见图1) 后,1 0 8份样品被检出金葡菌。 国标规定,金葡菌在血平板上生长菌落呈金 黄色, 有时为白色, 菌落周围有溶血圈。但试验中 发现大多数菌落在血平板上呈白色,仅个别呈金 黄色, 同时溶血圈的大小也有差异, 且此差异仅出 现在不同种类样品所分离的菌株中, 这与不同菌株 的溶血能力有关, 但血平板的质量也是一个重要的 因素。将同一批菌株接种于不同批次的血平板上, 不同批次的血平板上出现的溶血圈有的差异明 显, 而有的血平板上的标准菌株观察不到溶血圈, 表明血平板的质量对于此项鉴定很重要。试验中 可用标准菌株划线于血平板作阳性对照,以防因 血平板的质量问题而出现漏检。 血浆凝固酶试验中, 国标规定, 如血浆呈现凝 固, 即将试管倾斜或倒置时呈现凝块者, 被确认为 阳性结果。 其中呈现凝固没有定量的标准, 试验中 有些菌株凝固得牢固,而有些菌株的凝块具有大 小不一的流动性。 将出现半凝( 不包括纤维状和絮 状沉淀的凝固)的菌株提取基因组进行耐热核酸 酶P C R扩增, 结果发现只有1株半凝的菌株没有 跑出特异性条带,而出现全凝的菌株有3株未出 现特异性条带。 可见, 不能仅凭血浆凝固酶试验来 鉴定金黄色葡萄球菌。 2 . 2金黄色葡萄球菌在各大类样品中的分布 对采集的7大类食品样品进行金葡菌的分离 鉴定, 结果见表3。金葡菌对7类样品均有污染, 但其污染程度存在明显的差异。 其中, 生牛乳(3 8 .3 %) 和速冻食品(3 4 %) 中该菌的检出率高于日本报道 的平均值(3 2 . 5 %) 4 ; 生肉及熟肉制品的总检出率 高于生鲜肉;水产品、豆制品和果蔬的检出率较 低, 从而导致检出率的平均值低于报道值, 这与所 采集样品的种类、 采集地点有很大的关系。 扩增片段引物序列(5 3 )P C R产物大小 n u c片段 g c g a t t g a t g g t g a t a c g g t t a g c c a a g c c t t g a c g a a c t a a a g c 2 7 9 b p 表2引物序列与目的扩增产物大小 T a b l e2 P r i m e rs e q u e n c ea n de x p e c t e ds i z eo f t h en u c P C Rp r o d u c t 1 234567891 0 1 1 2 7 9 b p 注:1 .阴性对照 (H2O)2 . D L 2 0 0 0D N Am a r k e r 3 .阳性对照 4 1 1 .分离出的金黄色葡萄球菌。 图1金黄色葡萄球菌的P C R鉴定结果 F i g . 1 T h ei d e n t i g i c t i n gr e s u l t so f s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s b yP C R 食品中金黄色葡萄球菌污染状况研究8 9 中 国 食 品 学 报 2 0 0 8年第3期 表4肉制品中金黄色葡萄球菌的检出率 T a b l e4 T h ed e t e c t a b l er a t eo f S t a p h y l o c o c c u sa u r e u si n m a n u f a c t u r e dm e a t 熟肉制品 生肉包子馅腊肠卤肉香肠 样品份数1 292 18 检出份数1 0150 检出率/ %8 3 . 32 3 . 80 检测项目 生肉制品 1 1 . 1 样品份数/份阳性检样数/份检出率/ % 生牛乳6 02 33 8 . 3 生鲜肉2 0 04 22 1 肉制品5 01 53 0 水产品5 048 速冻食品5 01 73 4 豆制品5 024 果蔬5 051 0 总计5 1 01 0 82 1 . 2 2 . 3各类样品中金黄色葡萄球菌的污染状况 2 . 3 . 1生牛乳的污染状况本试验中生牛乳中金 黄色葡萄球菌的检出率为3 8 . 3 %。该菌在生牛乳 中的检出率有国家及地区的差异, 检出率在1 2 % 7 9 %之间不等 1 2 。我国生牛乳中金葡菌的检出率 在1 5 % 3 8 % 1 2 1 5 。Wi l o n等报道, 世界上约有1 % 2 %的奶牛患有各种类型的乳腺炎, 其中约有3 5 % 的奶牛患有亚临床型乳腺炎,金葡菌是引起乳腺 炎的重要病原菌 1 6 , 而患有乳腺炎的奶牛是污染 生鲜乳的主要原因。此外, 生鲜乳挤出后, 由于贮 藏罐和环境等消毒不合格,也会造成生鲜乳的二 次污染,这些原因共同导致了生鲜乳中金葡菌的 高检出率。T e r a y a m a报道农户奶桶和农场奶罐中 的污染率分别为6 5 . 9 %和6 5 . 4 %。国内曾有人采 集了3 4 0份生鲜乳进行检测,奶牛个体和混装奶 桶( 罐) 生鲜乳的污染率分别为3 9 . 0 %和5 8 . 8 % 1 7 。 因此, 要减少金葡菌对牛乳的污染, 除降低牛乳腺 炎的患病率外, 还应注意对贮藏罐和环境的消毒, 避免二次污染的发生。 2 . 3 . 2生鲜肉的污染状况生鲜肉中金黄色葡萄 球菌的检出率为生鲜猪肉(5 0份) 、 生鲜牛肉(5 0 份) 、 生鲜羊肉(5 0份) 和生鲜鸡肉(5 0份) 的平均 值, 其各自的检出率如图3所示。 生肉中金黄色葡萄球菌主要来源于恒温动物 ( 包括人类) 及环境, 在适合的条件下产生肠毒素。 生肉制品在食物链中对食源性致病菌的传播起重 要的作用,其中的金黄色葡萄球菌往往成为其它 产品( 如熟食等) 污染的重要来源 1 2 。本试验中将 生肉分为4类进行检样,主要是考虑到各种生肉 的销售环境相似,但不同种属动物生长及宰杀环 境不同, 宰杀后的带菌率也可能不同。 从图3可以 看出, 生鸡肉的检出率明显高于其余3种生鲜肉。 有报道称金葡菌在鸡舍环境中分布广泛,是一种 很常见的条件性致病菌, 存在于鸡的皮肤、 羽毛、 呼吸道以及肠道中 1 8 , 因此导致鸡肉的高检出率。 说明不同种属、不同饲养环境对金葡菌的存在有 一定影响。 2 . 3 . 3肉制品的污染情况采集的肉制品包括生 肉制品3 0份和熟肉制品2 0份。 分别从1 0份生肉 制品和5份熟肉制品中分离出了金葡菌,结果见 表4。 生肉制品( 生肉包子馅) 受金葡菌的污染状况 远高于上述生鲜肉(2 1 %) 的污染状况。这些生肉 馅均采自路边的包子铺,馅料的加工方式多为手 工加工, 再加上周围环境的污染, 使金葡菌的检出 表3 7类样品中金黄色葡萄球菌的分布 T a b l e3 T h ed i s t r i b u t i o no f S t a p h y l o c o c c u sa u r e u si n 7s a m p l e s 3 5 3 0 2 5 2 0 1 5 1 0 5 0 平均值生猪肉生牛肉生羊肉生鸡肉 检出率/ % 2 1 % 1 8 % 1 4 % 2 0 % 3 2 % 图2各类生鲜肉中球菌的检出率 F i g . 2T h ed e t e c t a b l er a t eo f S t a p h y l o c o c c u sa u r e u si n d i f f e r e n t r a wm e a t s a m p l e s 样品 9 0 第8卷 第3期 表5速冻食品中金黄色葡萄球菌的检出率 T a b l e5 T h ed e t e c t a b l er a t eo f S t a p h y l o c o c c u sa u r e u si n f r o z e nf o o d 检测项目 肉类非肉类 肉丸类水饺、 馄钝等粽子、 春卷等 样品份数2 01 041 6 检出份数1 5020 7 5 汤圆 5 000检出率/ % 率很高。2 0份熟肉制品中检出金葡萄的5份样品 均采自卫生环境较差的集贸市场。 2 . 3 . 4速冻食品的污染情况速冻食品:3 0份肉 类( 馄钝、 水饺、 肉丸类) 速冻食品和2 0份非肉类 速冻食品( 汤圆、 春卷、 粽子等) 。 其中1 5份肉类速 冻食品和2份汤圆中被检出金葡菌, 见表5。 据报道, 冰棍中金葡菌可存活2年以上, 在模 拟冰淇淋中可存活7年之久 1 9 , 因此冷冻食品一 旦被污染金黄色葡萄球菌, 可长时间带菌, 食用后 诱发疾病。本试验中肉丸类速冻食品金葡萄的检 出率高达7 5 %。速冻食品受金葡菌污染的主要来 源是加工用馅料,其原因可能是馅料加工过程中 诸多环节的影响造成的 2 0 。此外, 肉馅本身容易染 菌, 导致肉类速冻食品的污染几率高于非肉类速冻 食品。 2 . 3 . 5其它种类食品的污染情况所检豆制品 中,2 7份为即食型塑料袋装豆干类食品和红豆 馅,2 3份为散装豆制品和绿豆饮料。其中,1份豆 干类食品和1份绿豆饮料被检出金葡菌。 水产品中4份样品被检出金葡萄,其中3份 来自于大型超市,1份来自于集贸市场。金葡菌在 水产品中的检出率不高,但其在卫生条件较差的 集贸市场的检出率反而比超市的低,分析原因可 能是由于集贸市场细菌多,一些杂菌的生长抑制 了金葡菌的活性, 导致检出率偏低。 3 1份水果中5份样品被检出金葡菌,1 9份蔬 菜样品中均未检出金葡萄。被检出金葡菌的水果 采集于临街一水果摊, 周围车辆、 行人较多, 可能 是空气、 灰尘及人手污染所致。 2 . 4金葡菌的主要来源 金葡萄在7类食品中的分布比例如图3所 示。 从图3可以看出, 金葡菌主要来源于生鲜乳、 生鲜肉、 速冻食品和肉制品, 其中生鲜肉所占比例 最大,这与生鲜肉来自4种样品,样品基数(2 0 0 份) 大有关。 其次为生鲜乳、 速冻食品和肉制品。 其 中,肉类速冻食品的金葡萄污染高于其它速冻食 品。 3讨论 (1)金黄色葡萄球菌作为一种主要的食源性 致病菌一直是医学界研究的重点。这是因为金葡 菌在食品中分布的广泛性及对不良环境的抵抗能 力在非芽孢菌中最强 2 1 , 能产生耐热的肠毒素, 普 通的烹饪条件无法使其失活。因此, 在选购食品时 建议选择知名品牌的合格商品, 应在阴凉、 通风、 干 燥、 低温处贮藏食品, 以防止金葡菌肠毒素的产生。 (2)金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食 品: 食品加工人员、 炊事员或销售人员带菌, 造成 食品污染, 有2 0 % 3 0 %葡萄球菌肠毒素食物中毒 是由此引起的 2 2 ; 加工前食品带菌或加工过程受 到污染, 产生肠毒素, 引起食物中毒 2 3 ; 熟食制品 图3金黄色葡萄球菌在7类食品中的分布比例 F i g . 3 T h ed i s t r i b u t i n gp r o p o r t i o no f S t a p h y l o c o c c u s a u r e u si n7s a m p l e s 水产品 4 5 % 肉制品 1 4 % 生鲜肉 3 8 % 生牛奶 2 1 % 果蔬 5 % 速冻食品 1 6 % 豆制品 2 5 % 食品中金黄色葡萄球菌污染状况研究9 1 中 国 食 品 学 报 2 0 0 8年第3期 参 考 文 献 1 .刘秀梅.食源性微生物危险性评估 J .中华流行病学杂志,2 0 0 3,2 4(8) :6 6 5 6 6 9 . 2 .A t a n a s s o v aV,M e i n d l a,R i n g .P r e v a l e n c eo fS t a p h y l o c o c c u sa u r e u sa n ds t a p h y l o c o c c a le n t e r o t o x i n si nr a w p o r ka n d u n c o o k e ds m o k e dh a m - ac o m p a r i s o no f c l a s s i c a l c u l t u r i n gd e t e c t i o na n dR F L P - P C R J . I n t JF o o dM i c r o b i o l,2 0 0 1, 6 8(1 - 2) :1 0 5 1 1 3 . 3 .C y r i lJ S,D a v i d a S S,J e a n K,e ta l .S t a p h y l o c o c c u sa u r e u s:f r o m m a n o ra n i m a l s - a n e n t e r o t o x i n i c e b e r g ? C . P r o c e e d i n go fa ni n t e r n a t i o n a lE U - R A I N c o n f e r e n c eh o s t e db yt h ei s t i t u t oz o o p r o f i l a t t i c os p e r i m e n t a l ed e l le v e n e z i e, p a d u a,I t