《DNA复性动力学》PPT课件.ppt

DNA的复性动力学,DNA复性过程遵循二级反应动力学 DNA复性过程中单链消失的速度用公式表示： -dC/dt=kC2,其中，C是单位时间的单链DNA的浓度,K复性速度常数,DNA序列的复杂性、初始浓度、片段大小、温度、离子强度,DNA复性的影响因素：,1/C-1/ C0 = Kt,- dC / dt= KC2 积分,C / C0 = 1 / (1+KC0t ),当 C/ C0 = 1/2 时的C0t值定义为C0t1/2,C / C0 = 1/2 = 1 / (1+ KC0t(1/2),即复性反应完成一半时,- dC /C2= Kdt,当t=0，C=C0,不同DNA的Cot (1/2)值不同，与K值相关 DNA序列的复杂性影响K值: 在控制反应条件（初始浓度、温度、离子强度、片段大小）相同的前提下，DNA分子的C0t (1/2)值，取决于核苷酸的排列复杂性。 DNA序列的复杂性(complexity) X：最长的没有重复序列的核苷酸对的数值。 X= K Cot1/2,AAAAAAAA X = 1,ATCGATCGATCG X = 4 N 105 X = 105,Cot (1/2) = 1/K,复杂性X 1,不同原核生物的Cot曲线,复性分数（1-c/c0）,Cot曲线：表示复性速度与DNA顺序复杂性的关系。 相同核苷酸数量的DNA，复杂性小的DNA分子浓度高，复性快，Cot (1/2)值小，复杂性大的DNA分子复性慢，Cot (1/2) 大。,原核生物Cot曲线的特点： 形状相似（跨越2-3个数量级），Cot（12）不相同 单一序列 只是复杂性不同 高度重复序列Cot (1/2)值小 单一排列序列Cot (1/2) 大 poly(A) X=1 Cot(1/2)=2x10-6 T4 X=1.7x105 Cot(1/2)= 0.3,不同原核生物的Cot曲线,P74图16,真核生物DNA复性曲线的模式图 基因组为7X108 复性反应分为三相，每相代表不同复杂长度的序列类型,Cot1/2,所占比例,复杂性X,重复频率,2 重复序列(repetitive sequences),根据复性动力学研究将真核生物DNA序列归类： 单拷贝序列 轻度重复序列 中度重复序列 高度重复序列,1）单拷贝序列(single copy sequences) 又称非重复序列： 一个基因组中只有一个拷贝。 慢复性速度 单一序列的复性曲线常只有一个拐点，而重复序列常有多个拐点。 结构基因 (蛋白质基因)大多是单拷贝序列。,单拷贝顺序在基因组占50-80， 平均长度为13000bp 单拷贝顺序储存了巨大的遗传信息。 只有一小部分单拷贝序列编码蛋白质。,大部分结构基因位于非重复的DNA序列内,2）轻度重复序列(light repetitive sequences),在基因组中重复数2-10的重复顺序， 为慢复性速度。 少数在基因组中成串排列在一个区域，大多数与单拷贝基因间隔排列。 多为编码功能的序列,3）中度重复序列(moderate repetitive sequences),基因组中重复数十至数万（105）次的重复顺序， 复性速度快于单拷贝顺序，慢于高度重复顺序。 多与单拷贝基因间隔排列。 多为非编码序列，如Alu序列 也有编码基因产物的，如rDNA、tDNA、组蛋白基因家族, 一般往往以基因家族的形式组织。,rDNA gene family,Histone gene family, 组蛋白基因家族,TS: 可转录的间隔序列 NTS:不转录的间隔序列,NTS,NTS,Alu家族： 重复单位约300bp，由两个130bp重复序列及31bp间隔序列组成；重复30-50万次，分散存在；灵长类特有。约占人基因组的3-6。,真核生物的 Alu family,300,000 copies 广泛分布于非重复序列间,功能： 可能参与hnRNA的加工与成熟。 与遗传重组及染色体不稳定性有关。 有形成Z-DNA的能力。 可能具有转录调节作用。,还有许多其它家族如： Kpn家族、 Hinf家族、 多聚d-d家族等。,4）高度重复序列(highly repetitive sequences),在基因组中重复频率高，可达百万(106)以上， 复性速度很快。 序列一般较短，长10-300bp， 如真核生物的卫星DNA。,卫星 DNA序列(satellite DNA),螃蟹,2,ATATAT,果蝇,5,ATAATATAAT,老鼠,9,GAAAAATGAGAAAAATGA,重复碱基数 序列,特点： 高度重复序列， 重复单位由2-10bp组成， 成串排列，重复数以百万次 106。,卫星DNA：这类高度重复序列的碱基组成不同与其他部分，浮力密度也不同，用等密度梯度离心法可将其与主体DNA分开 。,真核基因组DNA中的G:C碱基对的分布与细菌不同，是不均一的，约4560的DNA中G:C碱基对含量较高，小部分的碱基对含量相对较低，由于有这种碱基组成分布的不均一，在等密度梯度超离心分离后，出现一个主峰和一、二个小峰，这种小峰对主峰而言尤似主峰的卫星， 所以称卫星DNA，它是多种短重复序列的混合物。按照重复序列的长度将卫星DNA分成3类：卫星DNA 小卫星DNA 微卫星DNA,卫星DNA的分类,(1) 卫星DNA：长串联重复序列，位于染色体上的异染色区域。 (2) 小卫星DNA重复序列(minisatellite) ：中等大小的串联重复序列，位于染色体末端，或其他部位。 高变小卫星DNA：重复单位之间的序列差异大，但是有一个核心序列GGGCAGGAXG, 近端粒部位； 端粒DNA： 主要有六个串联重复单位组成 TTAGGG,卫星DNA的分类,(3) 微卫星 (microsatellite, MS) 或为简短串联重复(STR, short tandem repeats ): 由更简单的重复单位组成的小序列，一般为26个碱基重复，如(CA)n, (GT)n, (CAG)n等， (CA)n最为常见。 在染色体DNA中散在分布， 其数量可达五到十万, 是目前最有用的遗传标记。,不同生物的非重复基因占基因组的比例差别很大；,原核生物无重复序列 低等真核生物 10-20% repetitive sequence 高等植物 80% 高等动物 50%,基因家族,1） 基因家族（gene family）：真核生物基因组中来源相同，结构和功能相关的基因聚集在一起形成基因家族。 根据分布形式分基因簇和散布的基因家族： 基因簇（gene cluster） 基因家族的各个成员紧密成簇排列成大段的串联重复单位，分布在某一条染色体的特殊区域； 它们可同时发挥作用，合成某些蛋白质。 如 组蛋白基因家族聚集在第7号染色体长臂3区内。,Histone gene family, 组蛋白基因家族,假基因（pseudogene）：具有与功能基因相似的序列，但由于有许多突变以致失去了原有的功能，所以假基因是没有功能的基因，用表示。 来源：一般认为是由mRNA反转录成cDNA，然后整合在基因组中,散布的基因家族（interspersed gene family）,概念：一个基因家族的不同成员成簇地分布不同染色体上，各成员在序列上有明显差异。 这些不同成员编码一组功能上紧密相关的蛋白质，如珠蛋白基因家族。,两种亚基的编码基因分别形成两个不同的基因簇，并存在于不同的染色体上.,人类珠蛋白基因家族典型的,血红蛋白,珠蛋白,血红素,22 不同的亚基由各自 的基因编码,2) 广义的基因家族,根据基因家族成员序列的相似程度分类： A 经典的基因家族，家族成员序列有高度的同源性，序列一致，拷贝数高，非转录间隔区短而一致。 B 基因家族各成员的编码产物保守（大段的高度保守氨基酸序列）；只是DNA序列的相似性低。 C 基因家族各成员的编码产物之间只有很短的保守氨基酸序列，DNA序列的相似性更低。 D 超基因家族，各基因序列之间无同源性，但其基因产物的功能相似。编码产物之间也无明显的保守氨基酸序列，但也有一些共同特征。,基因外的重复序列,即为无编码功能的重复序列 1) 串联重复DNA-卫星DNA(高度重复序列) 2) 散布的重复DNA,2) 散布的重复DNA,重复单位不成簇，分散在染色体的各个位点上。 A 短分散片段 B 长分散片段,A 短分散片段（short interspersed repeated segments, SINES）,特点： 长度约为300bp， 与长度约1000bp的单拷贝顺序间隔排列。 拷贝数可达10万左右。 如人的Alu家族。,B 长分散片段（long interspersed repeated segments, LINES）,