《CD细胞检测》PPT课件.ppt

CD4T淋巴细胞检测标准及要求,毛爱玲 山西省性病艾滋病监测中心,HIV在人体内的复制,1.吸附及穿入：gp120+CCR5 GP41和膜融合核衣壳穿入宿主细胞 2.脱衣壳和逆转录：P24+亲环素出壳RNA依赖的DNA聚合酶逆转录cDNA 3.环化：cDNA 双链环状DNA 4.整合：双股DNA整合入宿主细胞染色体DNA中前病毒 5.转录：前病毒DNA RNA mRNA 6.翻译与装配：Gag蛋白与病毒的RNA结合装配成核壳体。 7.病毒成熟、出芽：芽生方式释放,AIDS发病机理,HIV侵入人体后主要攻击的是一种带CD4抗原的淋巴细胞（T4淋巴细胞）。这种细胞是免疫系统的基本组成部分，HIV通过大量、不断地复制与释放，导致T4淋巴细胞进行性下降，感染者免疫功能遭到严重破坏，造成免疫缺陷。临床表现为各种各样机会性感染与肿瘤。,AIDS发病机理,HIV进入人体后能选择性地侵犯有CD4受体的淋巴细胞，当病毒颗粒释放出来后，继续攻击其他CD4T淋巴细胞。大量的CD4+T淋巴细胞被HIV攻击后，首先引起细胞功能的障碍。 HIV病毒在细胞内大量繁殖，导致细胞的溶解和破裂。,AIDS发病机理,3. HIV在细胞内复制后，以芽生方式释出时可引起细胞膜的损伤。由于HIV可抑制细胞膜磷脂的合成从而影响细胞膜的功能，导致细胞病变。 4. HIV还可以感染骨髓干细胞导致CD4+T淋巴细胞减少。,AIDS发病机理,5. 当受HIV感染的CD4+T淋巴细胞表面存在的gp120发生表达后，它可以与未感染的CD4+T淋巴细胞CD4分子结合，形成融合细胞，从而改变细胞膜的通透性，引起细胞的溶解和破坏。 6. 游离的gp120也可以与未感染的CD4+T淋巴细胞结合，作为抗体介导依赖性细胞毒作用的抗原，使CD4+T淋巴细胞成为靶细胞，受K细胞攻击而损伤。,AIDS发病机理,HIV感染后一般首先出现CD4T淋巴细胞轻度至中度降低，该细胞总数可持续数年不变，反应病毒为免疫应答所抑制。历经一段时间后， CD4+T细胞逐渐进行性下降，表明病毒逐渐逃脱了免疫应答的控制。当CD4+T淋巴细胞一旦下降至200细胞/l或更低时，则就可出现机会性感染。,HIV感染的三种结局,典型进展者：8-10年内免疫功能逐渐下降，最后发展成为艾滋病。 快速进展者：CD4+细胞计数在2-5年内迅速下降，抗HIV抗体水平很低，HIV感染后有较高的病毒载量。 长期存活者（长期不进展者）：感染后维持健康状态12年以上，且CD4+计数维持正常。,HIV infection,J. Coffin, XI International Conf. on AIDS, Vancouver, 1996,艾滋病的病程就象一列迫近悬崖的火车 病毒载量 = 火车的速度 CD4 计数 = 离悬崖的距离,从 HIV感染发展到艾滋病,HIV一旦进入人体，这个人就成为HIV感染者。经过急性感染期潜伏期，以后逐渐发展成艾滋病病人。处于潜伏期的感染者免疫功能没有受到严重破坏，因而没有明显的临床症状。从感染者到艾滋病病人这段潜伏期时间的长短与感染途径感染病毒的数量感染者的年龄、生活条件、心理、生理状况等多种因素有关，短则几年，长则20年。发达国家较长，发展中国家短些。资料表明，经输血传播的潜伏期较短，经性接触传播的潜伏期较长。,检测CD4、CD8T淋巴细胞的意义,淋巴细胞是机体免疫系统内功能最重要的一群细胞，在正常机体内各淋巴细胞亚群相互作用，维持机体正常免疫功能。当不同淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时，可导致机体免疫功能紊乱并发生一系列病理变化。因此，T淋巴细胞亚群的免疫分型能够提供有关患者免疫状态的重要信息。AIDS是由HIV引起的一组综合症，HIV主要侵犯人CD4T淋巴细胞，导致其数量上的减少和功能缺陷，使机体免疫平衡被打破造成免疫功能低下，最终导致各种机会感染和肿瘤,检测CD4、CD8T淋巴细胞的意义(续),CD4T淋巴细胞绝对值的检测在HIV感染和艾滋病病人治疗以及病毒治疗疗效方面发挥了重要的作用 1.了解机体的免役状态以确定疾病分期 2.监测疾病进程 3.评估疾病预后 4.制定抗病毒治疗及机会性感染预防性治疗方案 评估抗病毒药物疗效,检测CD4、CD8T淋巴细胞的意义(续),因而，对HIV感染者和AIDS病人定期进行CD4、CD8T淋巴细胞检测具有十分重要的意义。 美国疾病预防控制中心就是以此为基础制订了HIV感染者/AIDS病人的诊断和分类标准，目前国内外仍被采纳应用。,规范的AIDS治疗,目前我国HIV治疗范围逐渐扩大，国家示范区大批的治疗已经开始。我省也于2004年启动了对AIDS的治疗。但是由于检测费用昂贵，大批治疗中50%以上病人不进行规范检测.一旦出现耐药病人，后果将不堪设想。所以规范的实验室检测是非常重要的一个环节。,实 验 室 条 件,1.人员 进行HIV感染者和病人CD4+和CD8+T淋巴细胞检测的人员须具有艾滋病实验室的上岗资格，并接受过省级以上艾滋病实验室安全及实验操作技术培训。,实 验 室 条 件(续),设施和设备 样品处理区：生物安全柜、离心机、冰箱、水浴箱、旋转震荡器、精确移液器（5ul50u1、20u1200u1、 200u11000u1)。 流式细胞仪检测区：流式细胞仪,实 验 室 条 件(续),功能分区 实验室应分为样品处理区和流式细胞仪检测区，各区的功能是： 样品处理区应达到生物安全级实验室要求，用于样品处理、流式检测样品制备。流式细胞仪检测区用于制备好的样品上机检测。,方 法,目前用于CD4和CD8T淋巴细胞计数的检测方法分为自动检测方法和手工操作法。自动检测方法包括流式细胞仪（主要有多平台三级程序法和单平台一步法）和专门的细胞计数仪。手工操作法包括几种手工操纵试验，需要显微镜或酶联免疫试验设备。,方 法,检测CD4T淋巴细胞数的标准方法为流式细胞仪，可得出CD4,CD8等淋巴细胞及比值。为确保检测的准确性，应建立内部质量控制及参加国家室间评价。,流式细胞仪 (FACS Calibur, BD),简易流式细胞仪器（FACSCount, BD),免疫指标的检测,CD4/CD3 CD8/CD3 CD3 CD4/CD8,全省CD4流氏细胞仪分布,山西省艾滋病确证中心实验室 运城市艾滋病确证实验室 临汾市艾滋病确证实验室 太原市艾滋病确证实验室 大同市艾滋病确证实验室 长治市艾滋病初筛中心实验室,CD4细胞样本采集运送检测要求,1.成功的临床治疗效果评定依赖于有保障的标本采集、保存、检测，以及数据处理等等。在研究前期就要有计划的设计研究项目，确定所需要的标本类型。比如：所有的血液标本是否需要抗凝处理、是否需要无菌等,标 本 采 集 的 要 求,标本采集的要求(续),2.采集的标本应该长期保存，至少要求保存至此项目完成。血液标本可用于CD4T淋巴细胞 、抗原、抗体检测，病毒分离，PCR检测. 3.血液标本应尽量在24小时内处理，尤其是CD4T淋巴细胞检测、病毒分离，PCR检测.,标 本 的 采 集(续),选择合适的抗凝剂，分别用于血液学检测和流式细胞仪的免疫表型检测。 用于血液学检测的抗凝剂 K3EDTA （1.50.15mg/ml血液)。 枸橼酸钠 (3)肝素 在血球分析仪生产商允许的时间范围内检测，不超过30h，不检测超出抗凝时间范围的样品。 用于流式细胞仪的抗凝剂主要是K3EDTA,标本的采集,标 本 的 采 集,采集用品 采血管 真空、负压 抗凝（EDTA或枸橼酸钠） 无菌 针头 蝶形针头,采集用品： 采血套管 固定采血管位置，方便操作；保护操作者的安全,注意：切勿将采血针头的套管回套！ 注意采血后器具的放置、消毒、处理,标 本 的 采 集(续),标本的采集(续),采血后应立即握住试管两端，颠倒混匀多次，将血液与抗凝剂混匀，以防止凝固。 准备适当数量的样品管 当同一样品的血球检测和流式细胞仪免疫表型检测在同一实验室内进行时，用一个装有K3EDTA的试管即可。 对所有样品编号，并写明日期和时间。,标 本 的 运 输,在标本运输过程中，应确保标本能够及时、准确运输到指定地点。要求提前与对方联系，确定时间，对方应提前做好相关实验的准备工作，尽快进行标本处理 运输的所有标本都应有送检单给接受样品的实验室。每张送检单都应详细填写所要求的内容.,样 品 的 运 输 运 送(续),尽可能快地将样品送至免疫表型检测实验室。 如需运送样品到其它地点时，应将装样品的试管放于一个防漏的容器中，并将此容器放于一个装有吸水性物质的指罐中，以防止震动并可吸收所有试管破裂漏出的血液。盖紧指罐，用橡皮带系紧。 应选择特定的方案，并且安排合适的时间和运输样品。,样 品 的 接 收,样品到达以后立即检查试管及其所装的血样。 不可检测溶血或结冰样品。 不可检测凝血和乳糜的样品。 如果样品的采集时间已超过48H，不于接收.,标 本 的 处 理,一般采集HIV-1感染者全血10 - 20ml,血浆（含有血小板）,淋巴细胞层,红细胞层,实现 CD4, CD8 , CD3 绝对计数,FACSCount,结果可信度： 绝对计数 质控 内置错误自动报警,FACSCount,内置微处理器实现数据自动分析,自动打印质控与病人的检测结果,简单易用的系统控制面板,配套的样本制备工作台,样本制备方法简捷，避免细胞损失,FACSCount 试剂与对照,FACSCount 工作台,FACSCount 完善的系统,3步测定CD4, CD8 ，CD3 绝对计数,预配试剂,FACSCount 完善的系统,FACSCount 完善的系统,检测试剂盒组成（50人份/盒） 荧光试剂 2个组合/人份 CD4PE/CD3PE-CY5 CD8PE/CD3PE-CY5 固定液 效期 28 0C储存6个月,FACSCount 完善的系统,质控试剂盒（50人份/盒） 零，低，中，高 4种靶值微球 效期 28 0C储存1个月,FACSCount,3步测定CD4, CD8 ，CD3 绝对计数,每管加入 50ml 全血加入，混匀，室温避光孵育1h 无需溶血,1,FACSCount,FACSCount,每管加入 50ml 固定液，混匀，室温避光孵育30min 无需离心洗涤,2,FACSCount上机检测. 无需血球计数仪，直接得到绝对值结果,3,FACSCount,打印结果 对照 病人标本,FACSCount 分析,实验资料的记录,实验应及时、准确地记录结果。 实验记录中应包括以下内容：日期、操作者、所有样品、实验内容、过程（步骤）、结果及有无事故等。 整个实验室的实验资料要统一有专人负责，按固定格式记录在案。 计算机生成的实验结果，存档备案：定期拷贝计算机结果文档，备案保存。,HIV/AIDS CD4检测时间,一经抗-HIV确证的HIV/AIDS，应立即进行CD4细胞检测。（基线） CD4细胞