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CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS 2006 年第 25 卷第 3 期 324 化 工 进 展 谷氨酰胺转移酶处理对大豆分离蛋白、酪蛋白 酸钠和明胶可食膜特性的影响 姜燕，唐传核，温其标，杨晓泉 （华南理工大学轻工与食品学院，广州 510640） 摘 要：研究了谷氨酰胺转移酶（TGase）对大豆分离蛋白（SPI1和 SPI2） 、酪蛋白酸钠（NaCN1 和 NaCN2）及明 胶（G1和 G2）3 类蛋白质成膜特性的影响。研究表明在成膜溶液中加入 TGase（8U/g 蛋白） ，可以使 SPI、NaCN 和 明胶等 3 类蛋白质膜的抗拉强度和表面疏水性有不同程度的改善，其中抗拉强度增加的辐度为 13.1%(P0.05)，而 表面疏水性增加的辐度为 2%216%(P0.05)；明显降低了膜的水分含量、总可溶性物量及透光率。对于断裂伸长 率，TGase 的处理使 G1膜、NaCN2膜、G2膜、NaCN1膜和 SPI2膜分别增加 16.3%、16.8%、43.0%、72.6%和 440.5 ，而使 SPI1膜降低 7.5。SDS-PAGE 电泳分析表明 TGase 使这 3 类蛋白质均产生了共价交联。 关键词：谷氨酰胺转移酶；可食膜；蛋白质 中图分类号：TS 201.2 文献标识码：A 文章编号：10006618（2006）03032405 Effects of transglutaminase on properties of edible films from soybean protein isolates，sodium caseinate and gelatin JIANG Yan，TANG Chuanhe，WEN Qibiao，YANG Xiaoquan (Department of Food Science and Technology，South China University of Technology，Guangzhou 510640) Abstract：The effects of transglutaminase (TGase) treatment on the properties of edible films cast from soybean protein isolates (SPI1，SPI2)，sodium caseinate (NaCN1，NaCN2) and gelatin (G1，G2) were investigated. Tensile strength (TS)， elongation at break (EB)， moisture content (MC)， total soluble matter (TSM)，surface hydrophobicity (S0) as well as transparency of TGase-treated films and control films were evaluated after conditioning film specimens at 25 and 50% relative humidity (RH) for 48 h. TGase treatment significantly increased (P0.05) the TS and S0 values of most protein films by 13.1%33.2 % and 2.4%216.1 %，respectively，and simultaneously significantly decreased the TSM of all films by 21.2%69.9%. TGase treatment improved EB of films cast from SPI2，NaCN and gelatin，while reduced EB of SPI1 films. The transparency of TGase-treated films from SPI1， NaCN2 and G1 was lower than that of control. SDS-PAGE analyses confirmed the occurrence of cross-linking induced by TGase， which may account for the higher TS，S0 and lower TSM values (as compared to the control). Key words：tranglutaminase (TGase)；edible films；protein 近年来消费者对高品质、长货架期食品的需求 日益增长的同时， 由于废弃包装数量与日俱增而导致 的环保问题也成为公众关注的焦点。 于是， 从天然生 物材料发展可食的涂层和薄膜已经成为国内外科研 工作者研究的热点。 可食膜是指由可食材料构成的连 续薄层， 可以用作涂层或薄膜置于食品组分之间起到 防止质量传递的作用1，可以由蛋白质、多糖、脂质 或三者组合制备。 蛋白质膜具有营养价值高、 口感好、 隔油隔气性能好等特点，因而最具吸引力。然而，与 合成膜相比蛋白质膜的机械强度低、 透水性高是限制 收稿日期 20050922；修改稿日期 20051220。 基金项目 国家自然科学基金项目资助（No.20306008） 。 第一作者简介 姜燕 （1973） ， 女， 博士研究生。 Email 。 联系人 唐传核， 副教授。 电话 02087114262； Email 。 第 3 期 姜燕等：谷氨酰胺转移酶处理对大豆分离蛋白、酪蛋白酸钠和明胶可食膜特性的影响 325 其工业化生产和实际商业应用的原因。 改善蛋白膜特性的一种有效途径是采用化学方 法或酶学方法使蛋白质之间产生共价交联。谷氨酰 胺转移酶（TGase; EC3；全称为蛋白质谷胺 酰胺 谷氨酰胺基转胺酶） 是一种催化多肽或蛋白 质的谷氨酰胺残基的 羟胺基团（酰基的供体）与 许多伯胺化合物（酰基的受体）之间的酰基转移反 应的酶2 。TGase 可通过胺的导入、交联及脱胺 3 种途径改性蛋白质。本文以大豆分离蛋白（SPI1和 SPI2） 、酪蛋白酸钠（NaCN1 和 NaCN2）及明胶（G1 和 G2）等 3 类蛋白质为原料，探讨了 Tgase 处理用 于改善蛋白膜性能的可行性。 1 材料与方法 1.1 材料 商品级谷氨酰胺转移酶（TGB） ，泰兴市一 鸣精细化工有限公司；CBZ1glutaminylglycine 和 LGhuamic acid rmonohydoxamate，Sigma 公 司；大豆分离蛋白 SPI1（蛋白含量 85.2%） ，山东万 得福科技公司；大豆分离蛋白 SPI2（蛋白含量 92.1%） ，自制；酪蛋白酸钠 NaCN1（蛋白含量 88.3%） ，新西兰乳业集团；酪蛋白酸钠 NaCN2（蛋 白含量 81.3%） ，斯德宝香精香料有限公司；明胶 G1（蛋白含量 96.8%） ，沧州市金箭明胶有限公司； 明胶 G2（蛋白含量 98.6%） ，罗赛洛明胶有限公司； 甘油，分析级。 1.2 仪器 质构仪 TAXT2i，英国 Stable Mciro System； 22 PC 分光光度仪，上海凌光科技；悬滴振荡流变 仪 ODG 20 AMP，德国 Dataphisics Instruments GmbH；环境电子扫描显微镜 XL 30，Philips Electromics，Mahwah，N.J.。 1.3 实验方法 1.3.1 TGase 酶活性的测定 TGase 酶活性采用 Folk 和 Cole(1965)3报道的分 光 Hydroxamic acid（氧胶酸）分析法测量。反应物 0.1M TrisHCl 缓冲液，pH 值 6.0，30 mmol/L CBZ 1glutaminylglycine （N苄氧羰基谷氨酰甘 氨酸） ，0.1 mol/L hydroxylmine(羟氨)于 37 与酶 溶液反应 10 min 后，添加氯化铁/三氯乙酸试剂 (0.7%)中止酶反应，离心（8 000 r/min，15 min）去 除沉淀后，所形成的红色上清液于 525 nm 测定其 吸光度，用 LGlutamic acid monohydoxamic acidL谷氨酸单氧胶酸作标准曲线。1 单位 TGase（U）定义为在 37 ，pH 值 6.0 的条件下每 分钟产生 1 mol hydoxamic acid 所需要的酶量。 1.3.2 膜的制备 将各种蛋白质(5)和甘油(2)溶于 TrisHCl (pH 值 8.0) 缓冲溶液中，于水浴锅中加热 30 min （SPI70；明胶 45；NaCN80） 。待成膜溶液 冷却至室温后， 加入 TGase (8U/g 蛋白)， 搅拌均匀。 脱气后迅速薄摊在内衬有聚乙烯薄膜的玻璃器皿 （37 cm21 cm）中，然后放在室温（25）下干 燥 24 h，揭膜。以不加 TGase 的膜作为对照。 膜制好后裁切成所需要的样品形状，立即放在 相对湿度为 50的环境中平衡 48 h 备用。 1.3.3 膜性能指标测定 厚度、机械性能（抗拉强度 TS 和断裂伸长率 EB） 、表面疏水性 S0、水分含量 MC、总可溶性物 质量 TSM 及透光率的测定见参考文献4。 1.3.4 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDSPAGE） 电泳是根据 Laemmli 5的方法进行。分别在 0、 0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h 和 4 h 取蛋白质与酶的 反应液 0.5 mL 于事先装有 0.5 mL 样品缓冲液（pH 值 6.8，0.125 mol/L TrisHcl，2%SDS，5%2巯 基乙醇，10%甘油，0.05%溴苯酚蓝）的离心管中， 充分混合。电泳前将各离心管煮沸 5 min，分别于 每个离心管中取 6 L 溶液进样。 1.3.5 数据分析 采 用Microcal Origin V.6.1 software 和 SPSS11.5 进行方差分析和显著性分析。 2 结果与讨论 2.1 膜性能 2.1.1 机械性能 抗拉强度（TS）和断裂伸长率（EB）是评价机 械性能的两大指标。表 1 列出了 3 类天然蛋白质膜 （共 6 种膜）的 TS 值和 EB 值。从表 1 可见，各种 蛋白质热法成膜（不添加 TGase）时抗拉强度明显 不同，按照 TS 值由大到小的顺序依次是：G2膜 G1膜NaCN1膜NaCN2膜SPI1膜SPI2膜。 明胶膜和 NaCN 膜的抗拉强度明显高于 SPI 膜，这 可能是由于明胶和 NaCN 是线性蛋白，简单的线性 聚合物链容易形成紧密的基质结构，因而拥有较高 的抗拉强度；而 SPI 是球状蛋白，其 TS 值较低。 各种蛋白质热法成膜（不添加 TGase）时断裂伸长 率也明显不同（表 1） ，按照 EB 值由大到小的顺序 化 工 进 展 2006 年第 25 卷 326 表 1 谷氨酰胺转移酶处理对 3 种蛋白质膜抗拉强度（TS）和断裂伸长率（EB）的影响 对照膜 TGase 交联膜 蛋白质 膜厚/mm TS /MPa EB /% 膜厚/mm TS /MPa EB /% SPI1 0.0830.004 3.610.36af 120.315.8ch 0.1010.001 4.250.55b 111.324.1c SPI2 0.0720.002 2.710.20ae 19.42.5ce 0.0760.004 3.610.43b 105.025.9d NaCN1 0.0830.007 4.490.49ag 91.914.2cg 0.1090.004 5.080.33b 158.522.4d NaCN2 0.1000.005 3.860.19afg 87.86.6cg 0.1000.002 4.540.45b 102.618.4c G1 0.0680.004 6.800.69ah 68.89.4cf 0.0760.002 8.540.99b 80.013.3c G2 0.0630.001 7.891.17ai 55.812.9cf 0.0740.005 8.550.46a 79.813.5d 注：每一个数值都是多次重复（n5）的平均值加上标准偏差。a 和 b 表示 TS（同行）之间的显著性差异（P0.05） 。c 和 d 表示 EB（同行） 之间的显著性差异（P0.05） 。ei 表示对照膜中 TS（同列）或 EB（同列）之间的显著性差异（P0.05） 。 依次是：SPI1膜NaCN1膜NaCN2膜G1膜 G2膜SPI2膜。 TGase 处理， 使 6 类蛋白质膜的 TS 值均有显著 的增加(P0.05)。TGase 处理分别使 SPI2膜、G1 膜、SPI1膜、NaCN2膜、NaCN1膜和 G2膜分别比 对照膜增加了 33.2%、25.6%、17.7%、17.6%、 13.1%和 8.4%（见表 1） 。这可能是因为 TGase 使 蛋白质分子中产生了共价交联从而形成高分子聚合 物的缘故。适度的共价交联可以提高膜的 TS 值， 这与国内外的许多报道都相吻合6,7。 TGase 的加入，使 SPI2膜、NaCN1膜、G2膜、 NaCN2膜和G1膜的EB值分别增加了440.5%、 72.6%、 42.3%、16.8%和 16.3%，其中对于 SPI2膜、NaCN1 膜和 G2膜是显著性升高(P0.05)；而使 SPI1膜的 EB 值有所降低 (P0.05)。国外也有类似报道。 Larr 6报道，TGase 作用能够同时增加脱酰胺谷 蛋白膜的抗拉强度和断裂伸长率，因为 TGase 交 联产生的共价键具有足够的柔韧性。 而 Babin 等8 报道，TGase 的交联作用降低了明胶基质的流动 性， 在膜制备的过程中阻止了明胶分子复性形成三 螺旋结构， 从而在这种聚合物基质的纤维形成上造 成定向损失，降低了膜的断裂伸长率。TGase 作用 在断裂伸长率上带来的不同效果可能与具体的实 验条件有关， 如所使用的酶量、 酶作用时间及模式 等，而 TGase 适度的交联会增加膜的 EB 值。 2.1.2 表面疏水性 表面疏水性采用水滴与膜的接触角来表征，接 触角越大表明膜的疏水性越强。由表 2 可见 TGase 作用明显提高了蛋白膜的表面疏水性，其中对于 SPI1膜、NaCN1膜、NaCN2膜、G1膜效果更为显著 （P0.05） 。这可能是因为 TGase 处理使蛋白质中 更多的疏水核心或基团暴露出来。唐传核等9研究 指出，在 TGase 诱导的 SPI 絮凝和胶凝实验中，球 蛋白的碱性亚基和伴球蛋白的 亚基的疏水相互 作用是导致 SPI 形成絮凝和胶凝的主要原因之一。 2.1.3 水分含量和总可溶性物质量 从表 3 可见， TGase 作用使除 G2膜外的其他蛋 白质膜的水分含量均有所下降， 其中SPI1膜、 NaCN1 膜、和 NaCN2膜呈显著性降低(P0.05)。此水分 含量降低的原因可能是蛋白质的某些氨基酸残基的 游离基团，特别是赖氨酸残基的 NH2和谷氨酰 胺残基的CONH2因为交联失去了通过氢键来吸 附水分的能力。 作者采用了两种方法来测量总可溶性物质量。 对于未经 TGase 交联的 SPI2膜和 TGase 交联的 G1 膜来说，TSM 2值明显高于 TSM 1值(P0.05)。这可 能是由于第一种测量方法中，膜样在浸入水中之前 已被加热处理使膜中增加了新的交联，从而降低了 膜的溶解度的缘故10, 11。 无论是哪种方法， 经 TGase 处理的蛋白质膜的总可溶性物质量显著低于对照组 (P0.05)。NaCN1膜、NaCN2膜、G1膜、G2膜、 SPI2膜及 SPI1膜的 TSM2值经 TGase 处理后分别 下降69.9%、 50.9%、 48.9%、 32.3%、 31.9%和21.3%。 如同 TS 值升高一样，TSM 值的降低也表明在 TGase 催化交联的 SPI 膜中产生了新的交联。 2.1.4 透光率 TGase 处理对蛋白膜透光率的影响随蛋白膜的 种类及性质而异。例如，SPI1膜、NaCN2膜和 G1 膜经TGase处理后的透光率比对照膜略有降低(P 0.05)，这可能是由于 TGase 引起的蛋白质交联和聚 集使成膜溶液的浊度增加的缘故。而 TGase 交联的 SPI2膜、 NaCN1膜和 G2膜的透光率与对照膜几乎无 差别。SPI2、NaCN1和 G2经过热处理后在水溶液中 溶解度非常高，无论是否添加 TGase，其膜都是高 第 3 期 姜燕等：谷氨酰胺转移酶处理对大豆分离蛋白、酪蛋白酸钠和明胶可食膜特性的影响 327 度透明。 2.2 SDS-PAGE 本实验采用 SDSPAGE 考察了 TGase 与成膜 溶液中各种蛋白质作用的情况，结果如图 1 所示。 由图 1 可见，在实验条件下（还原状态）所采用的 几种蛋白质都能被 TGase 催化聚合。随着催化反应 的延长，各组分的量不断下降，而不能进入浓缩胶 的聚合物越来越多，少量分子量很大的生物聚合物 甚至不能进入浓缩胶。由于 SDS-PAGE 是在变性剂 (巯基乙醇)存在下进行的，于是可以断定新出现 的聚合物是通过二硫键以外的共价键形成聚合的， (a) SPI (b) NaCN (c) 明胶 图 1 TGase 催化交联的 SDS-PAGE 图 (pH 值为 8.0，25 。1、2、3、4、5、6 和 7 分别代表 SPI1、NaCN1 和 G1与 TGase 反应 0、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0 h 和 4.0 h 时所取样品； 8、9、10、11、12、13 h 和 14 分别代表 SPI2和 NaCN2 与 TGase 反应 0、 0.25、0.5、1.0、2.0、3.0 h 和 4.0 h 时所取样品；M 代表分子标准。) 表 2 谷氨酰胺转移酶对 3 种蛋白质膜的表面疏水性（S0）和透光率的影响 对照膜 TGase 交联膜 蛋白质 透光率/% 接触角/() 透光率/% 接触角/() SPI1 80.21.6b 25.56.0c 67.72.5a 56.36.0d SPI2 85.32.2a 59.32.5c 84.62.8a 60.04.2c NaCN1 84.12.9a 24.24.2c 82.41.2a 76.55.3d NaCN2 60.23.0b 53.85.3c 55.42.6a 71.62.6d G1 90.61.7b 98.02.3c 82.91.9a 100.31.7d G2 87.21.5a 87.76.0c 86.82.3a 89.85.8c 注：每一个数值都是多次重复（n10）的平均值加上标准偏差。 a 和 b 表示同行透过率之间的显著性差异（P0.05） 。c 和 d 表示同行接触角 之间的显著性差异（P0.05） 。 表 3 谷氨酰胺转移酶对 3 种蛋白质膜水分含量(MC)和总可溶性物量(TSM) 的影响 对照膜 TGase 交联膜 蛋白质 MC/% TSM 1/% TSM 2/% MC/% TSM 1/% TSM 2/% SPI1 26.31.5b 40.82.9d 39.71.8f 19.92.1a 32.60.2c 31.30.4e SPI2 22.50.5a 28.70.4d 41.71.5f 21.50.4a 26.80.6c 28.41.9e NaCN1 22.90.7b 95.32.2d 94.82.2f 20.30.3a 30.40.8c 28.61.7e NaCN2 25.50.1b 59.42.0d 60.12.5f 20.60.9a 30.80.3c 29.50.4e G1 21.22.1a 66.72.5d 67.83.1f 19.31.9a 36.82.4c 48.92.3e G2 18.91.9a 56.22.3d 54.91.2f 19.40.5a 36.10.5c 37.22.4e 注：每一个数值都是多次重复（n3）的平均值加上标准偏差。 a 和 b 表示同行 MC 之间的显著性差异（P0.05） 。c 和 d 表示同行 TSM 1之间 的显著性差异（P0.05） 。e 和 f 表示同行 TSM 2之间的显著性差异（P0.05） 。1 表示第一种测量方法，2 表示第二种测量方法。 化 工 进 展 2006 年第 25 卷 328 而不是二硫键和非共价键所导致。由图 1(a)可见 SPI2比 SPI1含有更多的球蛋白酸性亚基和碱性亚 基；在 SPI 中，几乎所有的 伴球蛋白和球蛋白 的酸性亚基参与了酶的交联过程。 NaCN 是 TGase 的良好底物，其所有的蛋白组分都可被 TGase 聚 合图 1(b)，这与 TGase 处理后 NaCN 膜的 TS 值 的显著升高（NaCN1膜和 NaCN2膜的 TS 分别比 对照膜增加了 13.1%和 17.6%）和 TSM 值的显著 下降（NaCN1膜和 NaCN2膜的 TSM 2 分别比对照 膜降低了 69.9%和 50.9%）是一致的。明胶也较容 易为 TGase 交联，然而相对于其他蛋白质来说， 催化时间的延长对于总体催化效果的影响不大图 1(c)。这与 TGase 对明胶蛋白膜表面疏水性的影 响是一致。 3 结 论 TGase 处理可明显增加能够催化大豆分离蛋 白、 酪蛋白酸钠和明胶这 3 类蛋白质膜的抗拉强度、 断裂伸长率（SPI1膜除外）和表面疏水性，同时也 明显降低了膜的水分含量、总可溶性物质量及透光 率。其作用机制是由于 TGase 催化蛋白质产生交联 的缘故。 参 考 文 献 1 Mahmoud R，Savello P A. J. J. Dairy Sci.，1993，76：2935 2 Cuq B，Aymard C，Cuq J L，et al. J. J. Food Sci.，1995，60： 13691374 3 Folk J E ， Cole P W. J. J. Biol. Chem.，1965， 240(7)： 25912960. 4 姜燕，唐传核，温其标，等. J.食品与发酵工业，2005，11，112 116. 5 Laemmli U K. J. Nature，1970，227：680685. 6 Larr C，Desserme C，Barbot J，et al. J. J. Agric. Food Chem.， 2000，48：54445449. 7 Mariniello L， Pierro P D， Esposito C， et al. J. J. Biotechnol.，2003， 102：191198. 8 Babin H，Dickinson E. J. Food Hydocolloids，2001，15(3)：2712