蛹虫草多糖提取及纯化工艺研究.pdf

江西农业学报 2007, 19(12) : 8082 Acta Agriculturae Jiangxi 蛹虫草多糖提取及纯化工艺研究 刘红锦 1 ,蒋 宁 1 ,李建军 1 ,连云岚 2 ,张 平 1 收稿日期: 2007 - 09 - 14 基金项目:江苏省农业科技攻关项目(BE2007318)。 作者简介:刘红锦(1965 - ) ,男,江苏人,副研究员,主要从事农产品加工技术研究。 (1. 江苏省农科院 农产品加工所,江苏 南京210014; 2.山西省药品检验所,山西 太原030001) 摘 要:采用以大米、 蚕蛹为主原料的培养基培养蛹虫草子实体。通过正交实验对蛹虫草水溶性多糖的提取工艺进行了 研究,利用蒽酮-硫酸法来测定多糖含量。发现90、 加水20倍、 分3次提取、 每次3 h为最佳提取条件。同时考查了不同除 蛋白方法对虫草多糖的蛋白去除效果。 关键词:蛹虫草;多糖提取;脱蛋白 中图分类号: S567. 35 文献标识码:A 文章编号: 1001 - 8581(2007) 12 - 0080 - 03 Study on Extraction and Purification of Polysaccharides fromCordyceps m ilitaris L IU Hong - jing 1 ,JI ANGNing 1 , L IJian - jun1, L I AN Yun - lan2, ZHANG Ping 1 (1. Institute ofAgricultural Products Processing, Jiangsu Academy ofAgricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2. Shanxi Provincial Institute forDrug Control, Taiyuan 030001,China) Abstract:The medium mainly containing rice and the pupa of silkworm was used to cultivate the sporocarp ofCordycepsm ilitaris. Extraction processing ofwater - soluble polysaccharide inCordyceps m ilitariswas studied through orthogonal experiment, and the an2 throne - sulphuric acidmethodwas used to determine polysaccharide content . Three times (3 hoursper times) extractionwith 20 times water at 90was the best extraction conditions .Simultaneously deproteinization effectwas examined with differentmethods . Key words:Cordyceps m ilitaris; Polysaccharide extraction; Deproteinization 蛹虫草(Cordyceps m ilitaris(L. )Link)又名北冬虫夏 草,属子囊菌亚门(Ascomycotina)核菌纲(Pyrenomycetes) 球壳目(Sphaerinles)麦角菌科(Claviticpitaceae)虫草属 (Cordyceps)。现代研究表明,蛹虫草的主要成分与冬虫 夏草类似,具有抗疲劳、 抗衰老、 增强免疫和性功能等作 用 1。其味甘性平 ,中医多用来治疗肺结核、 老人畏寒、 咳嗽、 衰弱、 产妇及老人贫血虚弱、 遗精、 阳痿、 自汗盗汗、 腰膝酸痛、 神经衰弱、 病后久虚、 咳血吐血、 慢性肾 炎等 2。 虫草多糖(CMPS)是蛹虫草中的重要的活性物质, 国内外科研人员对蛹虫草多糖的结构研究较多 3。如 盖新杰等报道虫草多糖的单糖组分为半乳糖 甘露糖=6 5,它以 (1 2) 连接的甘露糖为主干,支链由较大量的 (1 6) 半乳糖和较大量的 (1 2) 呋喃半乳糖构成, 分别连接在主干的0 - 4和0 - 6上,是含少量蛋白、 有高 度分支结构的杂多糖 4。虫草多糖已被证实具有抗肿 瘤、 降血糖、 抗肝纤维化作用及对单核巨嗜细胞系统的功 能具有增强作用,还能提高免疫功能及治疗肝的病毒性 感染等,具有广阔的开发前景。 本文进行了蛹虫草多糖的提取、 纯化工艺研究,以 期为虫草多糖的规模化生产提供理论依据。 1 蛹虫草子实体栽培 1. 1 实验材料和仪器 锥形瓶、 玻璃试管、 硫酸镁、 罐头 瓶、 大米、 蚕蛹粉;蛋白胨、 葡萄糖、VB等(市售,化学 纯)、 高压灭菌锅、 恒温摇床、 电子天平、 量瓶。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 菌种制作 1. 2. 1. 1 液体培养基制作 葡萄糖2%、 蛋白胨1%、 磷 酸二氢钾0. 05%、 硫酸镁0. 15、 维生素VB1适量,摇匀, 装入锥形瓶,用棉花塞或牛皮纸密封,高压灭菌30 min, 冷却备用。 1. 2. 1. 2 接种 在无菌的条件下,接入母种,摇瓶,接种 后放入温度为22 的环境中,培养710 d待用。 1. 2. 2 生产过程 1. 2. 2. 1 装料与封口 以500 mL罐头瓶为栽培容器, 冬季每瓶加20 g大米和50 mL添加剂。用12 cm12 cm0. 04 cm的聚丙烯塑料盖住瓶口,然后用硅胶皮筋 扎口。 1. 2. 2. 2 灭菌与接种 在1. 05 kg/cm 2 压力下灭菌1 1. 5 h,冷却到25以下接种。液体母种容量一般为 15 mL。 1. 2. 2. 3 菌丝培养 将接完种的瓶子放于2225 的 环境中,绝对避光培养。接种后34 d,在培养基的表面 及瓶壁周围出现短的绒毛状菌丝,在15 d后瓶壁处的气 生菌丝开始转色(转为橙黄色 ) , 22 24 d菌丝即可长满 培养基。 1. 2. 2. 4 子座形成 将培养瓶进行出草管理,控制温度 为1822、 保证散射光充足(光线最好直射瓶的顶 部 ) ,7 12 d后,培养基的表面开始出现细小的子座,待 肉眼可以看到子座时,加大通气量并维持环境湿度85% 为宜。 1. 2. 2. 5 采收 从子座的形成到采收大约需要2025 d。其成熟的标志是:子座长到5 cm左右,其顶部出现许 多小刺。 2 蛹虫草多糖提取工艺研究 2. 1 多糖测定方法 2. 1. 1 实验材料及仪器 电热恒温水浴锅(北京市医疗 设备厂生产 ) , 布氏抽滤漏斗, 95%乙醇,蒽酮、 浓硫酸 (均为分析纯 ) ; 岛津UV - 2501PC紫外分光光度计; 1200S M岛津电子分析天平。 2. 1. 2 测定波长的选择 取含量测定用D -无水葡萄 糖(中国药品生物制品鉴定所,批号110833 - 200302)于 105 下干燥至恒重,精密称取干燥后的D -无水葡萄 糖适量,加水溶解制成每毫升含0. 2 mg的溶液,作为对 照品溶液。在500700 nm范围内做光谱扫描,确定其 最大吸收峰在624 nm处,结果见图1。 图1 D -无水葡萄糖溶液光谱扫描结果 2. 1. 3 标准曲线 精密称取105 下干燥至恒重的D -无水葡萄糖对照品10 mg,置于50 mL容量瓶中,加蒸 馏水稀释至刻度,摇匀,制成对照品溶液。分别精密吸取 上述对照品溶液0. 5、1、1. 5、2、2. 5、3 mL于10 mL容量 瓶中,加水稀释至刻度,摇匀。再分别精密吸取1 mL于 10 mL纳氏比色管中,加入蒽酮试液0. 5 mL和浓硫酸3 mL,放冷至室温后,于624 nm处测定吸收度值。以水同 法加入试剂显色作为空白对照。分别以浓度为横坐标, 吸收度值为纵坐标做标准曲线,结果如图2所示。 2. 1. 4 测定方法 精密称取粗多糖10 mL用水定容于 50 mL容量瓶中,加水稀释至刻度,再精密吸取2 mL置 于10 mL容量瓶中用蒸馏水定容,摇匀,再精密吸取1 mL于纳氏比色管中,加入蒽酮试液0. 5 mL和浓硫酸3 mL,放冷至室温后,于624 nm处测定吸收度值,计算即 得多糖含量。 2. 2 蛹虫草多糖水提取工艺研究 2. 2. 1 实验材料 取蛹虫草子实体(浙江野老生物技术 有限公司提供 ) , 粉碎,过100目筛备用。 2. 2. 2 仪器 水浴锅、 天平、 搅拌器、 粉碎机、 筛网 (100 目)。 图2 D -无水葡萄糖溶液的标准曲线 2. 2. 3 提取工艺优化 用4因素3水平(温度80、90、 100;提取时间3、5、7 h;加水量10、20、30倍;提取次数 1、2、3次)进行正交实验,正交设计及实验结果见表1。 表1 蛹虫草多糖水提取工艺正交实验设计及结果 处理 提取温度 () 提取时间 (h) 加水量 (倍) 提取次数 实验结果 (%) 180310126. 1 280520238. 2 380730324. 2 490320352. 8 590530146. 6 690710235. 9 7100330237. 2 8100510341. 0 9100720150. 8 均值129. 50038. 70034. 33341. 167 均值245. 10041. 93347. 26737. 100 均值343. 00036. 96736. 00039. 333 极差15. 6004. 96612. 9344. 067 由表1实验结果可知,加水量和提取温度对蛹虫草 多糖提取的影响最大,提取时间和次数次之,最佳提取条 件为提取温度90、 加水20倍、 分3次提取、 每次3 h。 经2. 2. 4醇沉处理,计算粗多糖的得率为1. 84%。 2. 2. 4 醇沉 取提取滤液,冷却后以13体积加入95% 乙醇沉淀24 h,离心,过滤,沉淀分别用无水乙醇、 乙醚和 丙酮洗涤2次,60 下真空干燥得粗多糖。 3 粗多糖脱蛋白方法的比较 据刑小黑等介绍,粗多糖脱蛋白纯化以后其生物活 性更高 5。因此 ,为提高多糖的生物活性及应用价值,本 试验对粗多糖中蛋白质的几种去除方法进行了比较。 3. 1 实验材料和仪器 粗多糖样品(自制) , THZ - C - 1型定氮仪,LXJ - II B型离心机等。 3. 2 实验方法和结果 18 12期 刘红锦等:蛹虫草多糖提取及纯化工艺研究 3. 2. 1 实验方法 采用以下4种方法分别对粗多糖溶 液进行脱蛋白处理。 3. 2. 1. 1 Sevage法 配制质量浓度为1%的粗多糖溶 液,按体积比1/0. 24,加入样品及氯仿正丁醇混合液(其 中氯仿和正丁醇体积比为1 0. 2) 6 ,振摇30 min,离心 取上清液,重复以上操作5次。 3. 2. 1. 2 三氯乙酸法(TCA法) 配制质量浓度为l% 的粗多糖溶液,加入1% TCA,振摇20 min后静置30 min,然后离心除去沉淀,取上清液重复以上操作2次 7。 3. 2. 1. 3 氯化钙法 配制质量浓度为1%的粗多糖溶 液,调节pH值为89,加热至85,加氯化钙使其浓度 为5% (w/v) ,搅拌,冷却,离心 8。 3. 2. 1. 4 盐酸法 配制质量浓度为1%的粗多糖溶液, 向溶液中逐滴加入2 mol/L的盐酸溶液,调pH值为3, 4 下放置12 h,离心 8。 3. 2. 2 试验结果 采用蒽酮硫酸法测定多糖的含量(见 2. 1部分 ) , 采用定氮仪测定蛋白质含量,考察了4种方 法的多糖保留率和蛋白去除率,结果如图3所示。由图 3可见,蛋白去除率以盐酸法最高,而多糖保留率以 Sevage法最高。 图3 4种不同脱蛋白方法的多糖保留率和蛋白去除率 3 结果与讨论 本研究采用大米、 蚕蛹等为原料培养蛹虫草子实 体,该技术可规模化生产蛹虫草,为虫草多糖的提取提供 了价廉、 优质的原料,具有较大的推广应用价值。 采用水提醇沉的方法对蛹虫草多糖进行了提取,设 计正交实验优化了多糖的提取工艺,发现90、 加水20 倍、 分3次提取、 每次3 h为最佳提取条件。 在多糖的含量测定中,国内多采用显色试剂-硫酸 法,其原理是单糖、 多糖及其衍生物在硫酸作用下水解, 脱水生成醛类化合物,与酚类、 芳胺类等缩合成有色化合 物。如苯酚-硫酸法、 蒽酮-硫酸法、 -萘酚硫酸法及 咔唑-硫酸法,其中咔唑硫酸法用于糖醛酸类多糖的测 定。曾比较过苯酚-硫酸法,-萘酚硫酸法和蒽酮- 硫酸法,结果表明蒽酮-硫酸法比苯酚-硫酸法样品稳 定且重现性好。 通过对4种脱蛋白方法进行比较, Sevage法蛋白质 脱除率较高,且其多糖保留率最高,故确定其为脱蛋白方 法;但在实际生产中,因氯仿毒性较大,对人体危害较大, 不宜采用。氯化钙法成本低廉、 操作简单、 脱蛋白效果及 多糖保留率尚可。三氯乙酸法和盐酸法脱蛋白效果虽较 好,但多糖保留率低,且存在多糖水解的缺点,因而不宜 采用。故应继续开展多糖除蛋白工艺的研究,开发出安 全、 易操作、 适宜规模化生产应用的技术。 参考文献: 1张平,朱述钧,蒋宁,等.北冬虫夏草功能成分及保健作用分析 J .江苏农业科学,2003, (6) : 105107. 2董群,方积平.多糖在医药领域中的应用J .中国药物杂志, 2001,30(10): 649652. 3章灵光,肖培根.药用真菌中生物活性多糖的研究进展J .中 草药,1992,2