课件：DNArelicaionmuaioninjuryandreair解读.ppt

,（四）适应性突变 1988年凯恩斯等人于英国著名的Nature上，发表了一篇名为，The origin of mutants的文章， 发现了适应性突变。 凯恩斯所用的大肠杆菌的lacZ基因（其产物为半乳糖 ，可分解乳糖为葡萄糖和半乳糖）带有一个点突变，称为琥珀突变（amber mutation），这样的突变会使得lacZ基因产物转译（translate）不完全，故其产物会失去正常分解乳糖的功能除非有突变发生，使得lacZ的产物能完全转译，否则带有这种基因的大肠杆菌便无法生长在以乳糖为唯一碳源的培养平板上。,凯恩斯的实验结果可得到两个重要的结论 乳糖可诱使Lac +突变种持续产生，而不是因为饥饿所导致； 乳糖诱使细菌产生特定方向的突变，也就是乳糖只会诱使大肠杆菌的LacZ基因产生突变，而不影响其他的基因。,三、突变体的分离与分析,（一）突变体的分离： 分子生物学研究中，基因突变可以在体外按照人们的设计进行，但是仍然有很多不需要的突变体，因此需要分离，方法有： 利用遗传分析方法，筛选、选择、富集需要的突变体，常见的例子是利用抗性基因，使带有抗性基因的突变体可以生长，其它被杀死。 （二）突变体的分析： 遗传检测法 根据重组载体的抗药性标志筛选：,如抗氨芐青霉素（anpr）、抗四环素(terr)、抗卡那霉素(kanr)等。当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖，这就把凡未能接受载体DNA的细胞全部筛除掉了。 如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失。,例如质粒pBR322含有anpr、和terr两个抗药基因，若将目的序列插入terr基因序列中，转化大肠杆菌，让细菌放在含氨芐青霉素或四环素培养基中，凡未接受质粒DNA的细胞都不能生长； 凡在含氨芐青霉素和四环素中都能生长的细菌是含有质粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列， 凡在氨芐青霉素中能生长、而在四环素中不能生长的细菌就很可能是含有目的序列的重组质粒。,-半乳糖苷酶法 载体含有lacZ的蓝白筛选法：蓝白筛选法是一种利用蓝色化合物作为指示剂的筛选方法，筛选含有编码-半乳糖苷酶的基因。主要是在载体的非必要区插入一个大肠杆菌-半乳糖苷酶的基因片段lacZ。携带lacZ 的载体转入lac-的宿主菌后，在含有X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)和IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)平板上可形成蓝色菌落。外源基因插入lacZ（或lacZ被取代）后，重组子将丧失分解X-gal的能力。转入lac-的平板上可形成白色菌落。,2. 核酸杂交法： 利用标记的核酸做探针与转化细胞的DNA进行分子杂交，可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。常用的方法是Southern 印迹杂交和斑点杂交等。将转化后生长的菌落复印到硝酸纤维膜上，用碱裂菌，菌落释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含有目的序列的菌落DNA上而不被洗脱。核酸探针可以用放射性核素标记，结合了放射性核酸探针的菌落集团可用放射性自显影（autoradiography）法指示出来，核酸探针也可以用非放射性物质标记，通常是经颜色呈现指示位置，这样就可以将含有目的序列的菌落挑选出来。 3. PCR技术（见书）,四、突变与人类疾病,突变基因改变了原有的结构与功能，导致原有的遗传性状发生改变，其中一部分基因突变可导致遗传病或具有遗传倾向的病甚至肿瘤。如血友病是凝血因子基因的突变、地中海贫血是珠蛋白的基因突变等。具有遗传倾向的高血压病、糖尿病、溃疡病等系多基因变异与环境因素共同作用的结果。肿瘤是体细胞基因突变的结果。,苯丙酮酸尿症（phenylketonuria， PKU）苯丙酮尿症是一种常见的氨基酸代谢病，是由于苯丙氨酸羟化酶（PAH)的缺乏，使得苯丙氨酸不能转变成为酪氨酸，导致苯丙氨酸及其酮酸蓄积并从尿中大量排出。PAH基因有400多个不同的突变。 其中PAH基因中的第一个碱基对A-T被G-C取代，使mRNA的第一个密码子AUG（Met）变成了GUG（Val）。AUG是翻译的起始密码子，启动翻译的开始，而GUG不能起这个作用，导致苯丙氨酸羟化酶mRNA不能翻译。 另一种突变形式是R408，即mRNA第408个密码子上第一个碱基对C-G变成了T-A，密码子从CGG变为UGG。翻译出来的苯丙氨酸羟化酶活性降低。,血友病B（HB）：是FIX缺乏或其凝血功能降低的一种遗传性出血性疾病。本病发生是由于位于X染色体上的FIX基因突变所致。FIX是一种维生素K依赖性凝血因子，在肝细胞中合成。 21-羟化酶（CYP21）缺陷与先天性肾上腺皮质增生症。21羟化酶基因定位于第6号染色体短臂（6p21.3），与HLA基因族紧密连锁，由A基因（CYP21A）和B基因（CYP21B）两个基因座构成，CYP21B又称CYP2的，是21羟化酶的编码基因：CIP21A又称CYP21p，是无功能的假基因。CYP2的基因突变，包括点突变、缺点和基因转换等，致使21羟化酶部分或完全缺乏，由于皮质醇合成分泌不足，雄激素合成过多，致使临床出现轻重不等的症状。,五、基因突变在药物评价中的应用,Ames等人创立了一种快速测定诱变剂方法，即利用是否能引起鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型（his）菌株的回复突变来判断化学物质是否诱变剂和致癌剂。,第三节 DNA的修复系统 一、复制修复 (一）尿嘧啶糖基酶系统： 该系统能切除错误掺入的尿嘧啶核苷酸，首先由尿嘧啶N-糖基酶切除U；由AP内切酶切除与U相邻的一段核苷酸，形成缺口；由聚合酶I按正确的碱基配对合成填补缺口；由连接酶封闭缺口。,（二）错配修复： DNA错配修复基因是生物进化过程中的保守基因，有修复DNA碱基错配、增强DNA复制的忠实性、维持基因组稳定性和降低自发性突变的功能。 大肠杆菌在DNA复制过程中，有两种机制保证复制的正确性，一是Pol 的校正功能，即35外切酶活性，可将错误连接的核苷酸切除。但仍有错误的碱基合成到新链，这时由错配修复系统修复。,错配修复系统进行修复时首先要识别哪条链是含有错误碱基的新链，哪一条是需要保留的母链。大肠杆菌中识别标记就是母链中甲基化的腺嘌呤。 原核细胞内存在Dam甲基化酶，能使位于5GATC序列中腺苷酸的N6位甲基化。 复制后DNA在短期内（数分钟）为半甲基化的GATC序列，一旦发现错配碱基，即将未甲基化链切除一段包含错误碱基的序列，并以甲基化的链为模板进行修复。,错配修复系统组成（Mismatch repair system）,DNA polymerase；Helicase；SSB；外切核酸酶 (和)；连接酶。,MCE (mismatch correct enzyme) 3 subunits mutS, L, H,由mutS蛋白识别错配的碱基，并吸引mutL蛋白到这个位置，mutL蛋白激活mutH蛋白，在新链的GATC5端打开一个缺口,DNA helicase II, SSB, exonuclease I去除包括错配碱基的片段,DNA polymerase III 和DNA ligase 填充缺口,1. 错配修复系统作用机制,酵母的MMR系统中的5个mutS和3个mutL同源物,人类MMR包含9个错配修复基因，分别是hMSH2、 hMSH3、 hMSH4、 hMSH6、 hPMS1、hPMS2、 hMLH1、 hMLH3。 人体细胞中MMR系统对碱基错配的识别也依赖于DNA复制时模板链和新生链甲基化程度的差异。 任一MMR基因发生变异将导致错配修复系统缺陷。 人类MMR系统与大肠杆菌MMR相似，能够有效修复碱基错配和插入/缺失错配，但底物更宽，可以修复大肠杆菌不能修复的CC碱基错配；修复插入/缺失的能力强于大肠杆菌（小于16个核苷酸，大肠杆菌是小于7个）,2. 错配修复系统缺陷与人类疾病： MMR功能的丧失, 进而增加细胞的自发突变频率而使细胞出现所谓的突变子表型。 突变子表型被认为能够导致多步癌变过程所需的多重突变, 并使得基因突变的事件不断放大积累, 使大量错误信息遍布于整个基因组(包括癌基因、抗癌基因以及其他与肿瘤关系密切的基因) , 最终导致肿瘤的发生。 已经发现遗传性非多发性息肉型结肠癌 ( HNPCC )、散发性大肠癌、子宫内膜癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、白血病等与错配修复系统缺陷相关。,MMR 基因缺陷主要通过3 条途径促进肿瘤的发生与发展。 增加癌基因和肿瘤抑制基因的突变频率. 使一些重要的功能基因发生遗传不稳定性. 通过一些化学物质(如烷化剂等) 对细胞的损伤导致肿瘤发生。,2019/8/5,25,可编辑,(三）无嘌呤修复 DNA链中脱氧核糖与碱基形成的糖苷键比RNA中的糖苷键稳定性低，易发生自发水解作用，产生无嘌呤碱或无嘧啶碱位点，称去嘌呤/嘧啶作用，去嘧啶比去嘌呤速度低20倍。自发的去嘌呤作用是突变的主要来源。如果无嘌呤位点的DNA在修复前进行复制，则在新链上相应的位点总是插入一个腺嘌呤核苷酸，这样在后一轮复制时如果原来为G-C对将变成T-A对，造成碱基转换突变。 细胞内有一种无嘌呤内切酶（AP内切酶），能切除DNA中无碱基核糖，留下一段单链DNA区域通过DNA聚合酶填补，DNA连接酶封闭最后缺口，使这种突变得到修复。,Repair of AP site,二、损伤修复,（一）光复活修复（photoreactivation repair）可见光存在的条件下，在光复活酶作用下将UV引起嘧啶二聚体分解为单体的过程。 光复活酶与T=T结合形成复合物; 复合物吸收可见光切断T=T之间的C-C共价键, 使二聚体变成单体; 光复活酶从DNA链解离。,（二）甲基转移酶 鸟嘌呤第6位可被甲基化（如烷基化），成为O6-甲基鸟嘌呤（O6-G）， O6-G能与T配对从而使下一轮复制中G-C对变成A-T对。O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶（O6-methyl-guanine methyltransferase）能除去O6位上的甲基恢复正常。,（三）切除修复（excision repair） 是一个多种酶参与的反应过程，就是将损伤的DNA片段切除，用正常链作为模板重新合成一段DNA取代损伤的片段。包括两种类型： 碱基切除修复（base excision repair， BER）。 指切除和替换由内源性化学物作用产生的DNA碱基损伤, 是切除修复的一种。 受损碱基移除是由多个酶来完成的。 主要针对DNA单链断裂和小的碱基改变及氧化性损伤。,Base Excision Repair,2. 核苷切除修复（nucleotide excision repair，NER） 虽然碱基切除修复能够修复大部分损伤，但是它只能修复能够被特异性的糖基酶所识别的特定类型的碱基损伤，实际上DNA损伤类型的数量要远远多于糖基酶的数量。核苷切除修复能够修复一些不同的、非特异的DNA加合物。 核苷切除修复对损伤的识别是依靠损伤所致DNA扭曲的改变来实现的。NER修复时，切除损伤碱基的那一段DNA，而不是仅仅切除受损的碱基。这一复杂过程需要大量蛋白质参与。,大肠杆菌中NER由UvrA、UvrB和UvrC共同完成。其修复过程为： 蛋白UvrA、UvrB识别损伤部位，识别过程中， UvrA、UvrB形成二聚体，一旦损伤部位被识别，UvrA帮助UvrB与损伤部位结合的更加紧密； 蛋白UvrA从DNA上脱落，UvrC开始与UvrB结合，共同作用于DNA； UvrB切断损伤侧的DNA，UvrC切断正常侧的DNA，UvrD切除损伤的DNA单链，并在双链上留下一个缺口； DNA聚合酶合成一段DNA来填补这个缺口； DNA连接酶进行连接缺口。,哺乳动物细胞内，NER反应由核内的NER因子；XPA、RPA、XPC、TFC、XPC和ERCC1-XPF共同完成核苷酸切除修复（图为人类）,三、复制后修复（postreplication repair）,（一）大肠杆菌的重组修复系统（recombination repair） DNA复制时，DNA聚合酶到达一个损伤位置（如T双聚体），就停止DNA链的合成。等待一段很短的时间后，跳过损伤部位，DNA合成重新开始，复制完成后产生了两个子代DNA分子，一个是正常的DNA双链结构，另一个是新合成的带有缺口的DNA分子。,细胞内的重组修复系统可修复有缺口的DNA分子：主要是Rec（A，B，C，D）蛋白 将另一条正常母链上的一段与损伤子链缺口同源的DNA片段（供体）转移到子链缺口上（重组），形成完整子链，但在供体母链形成一个缺口。 供体母链的缺口以子链为模板，由DNA聚合酶 I 进行合成修复，形成正常的双链。,SOS修复系统,差错倾向修复（Error prone repair） Jeam Weigle 等发现 UV 感染 细菌(用UV照射过) 存活率高 噬菌体 细菌(UV未照射过) 存活率低 UV-复活（UV-reactivation），也称W-复活 SOS反应（SOS response）,（二）SOS修复（SOS repair system） SOS修复是指DNA分子受损伤的范围较大，在复制受到抑制时出现的一种应急修复作用。SOS修复允许新生的DNA链越过嘧啶二聚体或其他损伤造成的DNA分子变形部位继续进行。 在正常情况下，修复蛋白的合成 是处于低水平状态的，这是由于它们的mRNA合成受到阻遏蛋白LexA的抑制。细胞中的recA 蛋白也参与了SOS修复。,当DNA两条链的损伤邻近时，损伤不能被切除修复或重组修复，这时在核酸内切酶、外切酶的作用下造成损伤处的DNA链空缺