《核酸分析技术OK》PPT课件.ppt

核酸分析技术,电泳技术,负 极,正 极,电泳现象 带电粒子在电场中的定向移动,电泳技术 利用电泳现象进行分离分析的技术,样品的电荷效应 带电多，迁移快,琼脂糖凝胶电泳,凝胶的筛选效应 分子量小，阻力小，迁移快,主要用于分离鉴定核酸,琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物 根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖 低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在37下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等,琼脂糖凝胶电泳分离DNA,凝胶制备 上样 电泳 染色 结果观察,琼脂糖凝胶电泳分离DNA,凝胶制备,不同类型琼脂糖的性质,电泳缓冲液,常用三种缓冲液 Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)、Tris-磷酸(TPE) TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀 TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解,琼脂糖凝胶电泳分离DNA,凝胶制备,琼脂糖凝胶电泳分离DNA,2. 上样,三个作用： 1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内； 2）使样品带有颜色便于简化上样过程； 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。,核酸电泳的上样缓冲溶液,6凝胶载样缓冲液,核酸电泳的指示剂,指示剂：溴酚兰、二甲苯青 溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色，电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段 二甲苯青：水溶液呈兰色，电泳时，其迁移速率与双链线性DNA大致相当,琼脂糖凝胶电泳分离DNA,3. 电泳,琼脂糖凝胶电泳分离DNA,4. DNA染色,溴化乙锭,核酸电泳的染色剂溴化乙锭,一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光 可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色1015min 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng 溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察,ethidium bromide，EB,琼脂糖凝胶电泳分离DNA,5. 结果观察,DNA的迁移速率决定因素,1 DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比； 2 琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快；,3 DNA的构象 超螺旋环状线状切口环状。 4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。,5 所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。 6 琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；,样品的电荷效应和凝胶的筛选效应是分离的主要依据,凝胶是由丙烯酰胺聚合而成,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,在TEMED (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。 在双功能交联剂如N，N-亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。 网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。,（一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质,优点 聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。,（二） 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类,1 变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离或纯化。 变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。 用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。,2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用途：制备高纯度的DNA片段。, 染色 考马斯亮蓝染色 考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。,银染色 银染色液中的银离子(Ag )可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag 还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色。 也用于琼脂糖凝胶染色。其灵敏度比EB高200倍。但银染色后，DNA不宜回收。, DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围,注:N,N-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30;,PAGE电泳装置,PAGE的结果观察,考马斯蓝染色,凝胶成像仪扫描,末端终止法Sanger 2，3双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成链延伸的抑制剂。,核苷酸序列测定,DNA序列分析仪： 四色荧光基团标记的dNTP,（二）DNA的化学法测序： 由Maxam和Gilbert所发明。 其基本原理是用特异的化学试剂作用于DNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。用4组不同的特异反应，可使末端标记的DNA分子切成不同长度的片断，其末端都是该特异的碱基。经变性