基因突变和诱变育种.ppt

微生物学,第二节 基因突变和诱变育种,基因突变 诱变育种,一、基因突变（genemutation）,一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变,简称突变，是变异的一种，泛指细胞内（或病毒粒内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。,突变几率一般很低（10-610-9）,从自然界分离到的菌株，简称野生型。,野生型经突变后形成的带有新性状的菌株，又称突变体或突变型。,突变株（mutant）,野生型菌株（wild type strain）,（一）突变类型,凡能用选择性培养基（或其他选择性培养条件）快速选择出来的突变株。,选择性突变株（selective mutant）,非选择性突变株（non-selective mutant）,反之。,表型,基因型,这里主要介绍几种常用的由于基因突变而造成微生物表型变化 的突变型及其分离,link1,突变株的表型,非选择性突变株,选择性突变株,抗性突变型（株）,营养缺陷型（株）,条件致死突变型（株）,形态突变型（株）,抗原突变型（株）,产量突变型（株）,突变率,每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率,例如，突变率为10-8的， 指该细胞在1亿次细胞分裂中，会发生1次突变。,某一单位群体在每一世代（即分裂1次）中产生突变株（mutant，即突变型）的数目来表示,例如，一个含108个细胞的群体，当其分裂为2108个细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是10-8。,（二）突变率（mutation rate）,突变一般是独立发生的。,某一基因发生突变不会影响其他基因的突变率。,同一细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的。,（三）基因突变的特点,基因突变的7个共同点,（1）自发性,各种性状的突变， 可在无人为的诱变因素处理下自发地产生。,（2）非对应性,突变的性状与引起突变的原因间 无直接的对应关系。,这是突变的一个重要特点，也是容易引起争论的问题,（3）稀有性,自发突变虽可随时发生， 但其突变率却是极低和稳定的，一般在10-610-9间。,某基因的突变率不受它种基因突变率的影响。,（5）可诱变性,自发突变的频率可因诱变剂（mutagen）的影响而大为提高（10105倍）。,（4）独立性,基因突变后的新遗传性状是稳定的、可遗传的。,野生型菌株某一性状可发生正向突变（forward mutation），也可发生相反的回复突变（reverse mutation或back mutation ，也称回变）。,（7）可逆性,（6）稳定性,（四）基因突变自发性和不对应性 的实验证明,如何证明基因突变的非对应性？,观点一： “驯化”或“驯养”,认为，突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境诱发出来的，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是“定向变异”，也有人称它为“驯化”或“驯养”。,观点二：自发产生,另一种看法则认为，基因突变是自发的，且与环境是不相对的。由于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等多种因素错综在一起，所以难以探究问题的实质。,证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！,三个经典实验,变量实验、涂布实验、影印实验,1.变量试验(略)（fluctuation test）,又称波动试验或彷徨试验。1943年，S. E. Luria和M. Delbrck根据统计学的原理，设计实验。,Salvador Luria,Max Delbruck,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969,甲管,乙管,2.涂布试验(略) （Newcombe experiment）,1949年，H.B.Newcombe在NATURE上发表了一篇与变量试验属同一观点的但实验方法更为简单的涂布试验结果。,3.平板影印培养试验（replica plating）,1952年，J. Lederberg夫妇发表了一篇著名的平板影印培养法和细菌突变株的间接选择论文，它更好地证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发地产生的，这一突变与相应的药物环境毫不相干。,影印的作用是保证这3个平板上所长出的菌落的亲缘和相对位置保持严格的对应性。,Joshua Lederberg,J. Lederberg is awarded the Noble Prize in Medicine and Physiology in 1958,（五）基因突变极其机制,仅影响一对碱基,影响一段染色体,诱发突变简称诱变，是指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段。,1.诱发突变（induced mutation）,凡具有诱变效应的任何因素，都称诱变剂（mutagen）。,(1)碱基的置换（substitution）,碱基的置换只涉及一对碱基被另一对碱基所置换，属于典型的点突变（pointmutation）。,染色体的微小损伤（microlesion）,碱基的置换,转换（transition）,颠换（transversion）,一个嘌呤,另一个嘌呤,一个嘧啶,另一个嘧啶,一个嘌呤,另一个嘌呤,一个嘧啶,另一个嘧啶,置换的机制, 直接引起置换的诱变剂,一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的化学诱变剂，在体内（in vivo）或离体（in vitro）条件下均有作用。,各种烷化剂（alkylating agent）等,硫酸二乙酯（DES）， 甲基磺酸乙酯（EMS）， N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍， N-甲基-N-亚硝基脲， 乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等。,亚硝酸,羟胺,它们可与一个或几个碱基发生生化反应， 引起DNA复制时发生转换， 能引起颠换的诱变剂很少。, 间接引起置换的诱变剂,引起这类变异的诱变剂都是一些碱基类似物（base analog）。,5-溴尿嘧啶（5-BU）、 5-氨基尿嘧啶（5-AU）、 8-氮鸟嘌呤（8-NG）、 2-氨基嘌呤（2-AP） 6-氯嘌呤（6-CP）等。,它们的作用是通过活细胞的代谢活动掺入到DNA分子中 后而引起的，故是间接的。,(2)移码突变（frame-shift mutation，phase-shift mutation）,指诱变剂使DNA序列中的一个或少数几个核苷酸发生增添（插入）或缺失，从而使其后面的全部遗传密码发生阅读框发生改变，并进一步引起转录和转译错误的一类突变。,由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株（frame-shift mutant）。,DNA分子的微小损伤,点突变,能引起移码突变的有效诱变剂吖啶类染料,原黄素,吖啶黄,吖啶橙,-氨基吖啶,ICR类的化合物,由吖啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变图示： （双线部分代表正常密码子，单线部分表示不正常）, 正常DNA链上的三联密码子：, 第三个密码子中增添一个碱基后的三联密码子：, 在第二个密码子上缺失一个碱基A后引起的变化：, 增添一个碱基和缺失一个碱基后，其后的密码子又恢复正常：, 如缺失三个碱基，也只引起一段密码子不正常：, 增添三个碱基后，只引起一段密码子不正常：,(3)染色体畸变（chromosomal aberration）,电离辐射（X射线等） 烷化剂 亚硝酸等,某些强烈理化因子,引起,点突变,DNA的大损伤（macrolesion）,DNA的大损伤（macrolesion）,染色体畸变,缺失（deletion）,重复（duplication）,插入（insertion）,易位（translocation）,倒位（inversion）,染色体结构上,染色体数目的变化,DNA序列通过非同源重组的方式， 从染色体某一部位转移到 同一染色体上另一部位 或其他染色体上某一部位的现象， 称为转座（transposition）。,凡具有转座作用的一段DNA序列，称转座因子 （transposible element，TE），又称跳跃基因 （jumping gene）、可移动基因（moveable gene）、 可移动遗传因子（mobile genetic element）。,转座因子,插入序列（insertion sequence，IS）,转座子（transposon，Tn）,Mu噬菌体（mutator phage）,转座噬菌体（transposable phage）,原核生物,E. coli,进化研究 抗药性产生机制 各种研究用的突变株的获得,转座作用的频率为10-510-7,“自发基因工程”、“内源性基因工程”,转座因子的特点, 在转座时，通过转座因子的复制，可将新形成的拷贝以非同源重组的方式转移到染色体的新部位上； 在转座因子两端各有一段一定长度的末端重复序列，包括正向重复（direct repeat）和反向重复（inverted repeat，或颠倒重复）； 每个转座因子还带有一个对转座有特异功能的转座酶基因（transposase gene）。,2.自发突变（spontaneous mutation）,自发突变（spontaneous mutation）是指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变。,自发突变的原因,（1）背景辐射和环境因素,（3）DNA复制过程中碱基配对错误,（2）微生物自身有害代谢产物,一个1000bp的基因自发突变频率约为10-6,例如，过氧化氢等,例如，天然的宇宙射线等,（六）紫外线对DNA的损伤及其修复,嘧啶（敏感性）嘌呤,紫外线（ultraviolet ray，U.V.）,嘧啶二聚体（TT，TC，CC）和水合物,把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。,1. 光复活作用（photoreactivation，photorestoration）,最早是A. Kelner（1949）在Streptomyces griseus（灰色链霉菌）中发现的。后来，在许多微生物中都得到了证实。,最明显的是在E.coli的实验 对照：8106个mLE.coli 100个mLE.coli 试验：8106个mLE.coli2106个mLE.coli,UV,UV,360490nm,可见光，30min,使二聚体（dimer）重新分解成单体（monomer）,带有嘧啶二聚体的DNA分子,DNA分子,UV照射,黑暗下结合,光激活酶光解酶 （光裂合酶，photolyase）,复合物,300500nm可见光 获得光能而激活,释放光解酶,在一般的微生物中都存在光复活作用，在利用UV进行诱变育种等工作时，应在红光下进行照射和后续操作，并放置在黑暗条件下培养。,注 意,2.切除修复（excision repair）,是活细胞内一种用于修复被UV等诱变剂（包括烷化剂、X射线和射线等）损伤后DNA的修复方式之一，又称暗修复（dark repair），通过酶切作用去除嘧啶二聚体，随后重新合成一段正常DNA链的核酸修复方式。,酶切,合成,切开,切除,聚合,连接,二、突变与育种 （一）自发突变与育种 （breeding by spontaneous mutation） 1. 从生产中育种,在生产第一线易获得较优良的生产菌株。,2. 定向培育优良菌株,定向培育是一种利用微生物自发突变，并采用特定的选择条件，通过对微生物群体不断移植以选育出较优良菌株的古老方法。,（二）诱变育种（breeding by induced mutation）,诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合育种目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。,筛选,诱变,诱变育种,定向的更重要,随机的,可获得供工业和实验室应用的各种菌株； 提高有用代谢产物的产量； 减少杂质、提高产品质量、扩大品种和简化工艺等。,诱变育种具有重大的实践意义,诱变育种的特点,（1）提高突变率，扩大突变谱 （2）有效地改良个别、单一性状 （3）缩短育种年限 （4）定向变异和有益突变的频率低,1. 诱变育种的基本环节,出发菌株,纯化、同步培养,培养液,离心收集细胞，洗涤，制菌悬液玻璃珠打散，过滤,细胞或孢子悬液,诱变处理,平板分离,初筛,复筛,保藏及扩大试验,活菌计数，诱变预备试验,存活细胞计数，致死率计算,变异率计算,2. 诱变育种中的原则 （1）选择简便有效的诱变剂,诱变剂 （mutagen）,物理因素,化学诱变剂,非电离辐射类的紫外线、激光和离子束（ion beam，有小型加速器提供）等,引起电离辐射的X射线、射线和快中子等,主要有烷化剂、碱基类似物和吖啶类化合物,烷化剂可与巯基、氨基和羧基等直接发生反应，更易引起基因突变。,最常用的烷化剂 N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（NTG）、 甲基磺酸乙酯（EMS）、 甲基亚硝基脲（NMU）、 硫酸二乙酯（DES）、 氮芥、乙烯亚胺和环氧乙烷等。,拟辐射物质,氮芥、硫芥和环氧乙烷等,各种点突变,一般只有辐射才能诱发的,染色体畸变,诱发,出发菌株（original strain）是指用于育种的原始菌株，选用合适的出发菌株有利于提高育种的效率。,（2）挑选优良的出发菌株,合适的出发菌株来源： 由自然界直接分离获得的野生型菌株； 在生产中经历生产条件考验的菌株； 已经过诱变甚至多次改造的菌株； 选用对诱变剂敏感性较高增变变异株；等等。,在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞、均匀的悬液状态。,（3）处理单细胞或单孢子悬液,菌悬液制备目的在于提高诱变处理的效果,因为: 一方面，分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂， 另一方面，又可避免长出不纯菌落。,诱变剂一般只作用于DNA双链中的某一条单链，故某一突变还是无法反映在当代的表型上。只有当经过DNA的复制和细胞分裂后，这一变异才会在表型上表达出来，于是出现了不纯菌落，这就叫表型延迟（phenotypiclag）。,用于诱变育种的细胞应尽量选用单核细胞， 例如，细菌的芽孢； 霉菌或放线菌的分生孢子。,诱变剂的作用有三条： 一是提高诱变的频率 二是扩大变异的幅度 三是使变异向正变的方向移动（产量提高）,（4）选用最适的诱变剂量,凡在提高诱变率的基础上，既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量。,通过比较上述两曲线，可找到 某诱变剂的剂量存活率诱变率 三者的最佳结合点。,通常采用低剂量、长时间处理。,诱变剂的复合处理常常表现出明显的协同效应，这对育种工作是有利的。,（5）充分利用复合处理的协同效应（synergism）,复合处理有几类： 两种或多种诱变剂的先后使用； 同一种诱变剂的重复使用； 两种或多种诱变剂的同时使用。,为了大大提高育种时初筛的效率，必须进行大量的分析测定和统计工作，并找到形态变异与产量变异两者间的相关性。,（6）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标,利用鉴别性培养基的原理或其他途径，就可有效地把原先肉眼无法观察的生理性状或产量性状转化为可见的“形态”性状。 快速平板检出法,在琼脂平板上，通过观察测定某突变菌落周围 蛋白酶水解圈的大小、 淀粉酶变色圈（用碘液使淀粉显色）的大小， 氨基酸显色圈（将菌落用打孔机取下，转移到滤纸上，再用茚三酮试剂显色）的大小， 柠檬酸变色圈（可在厚滤纸上培养，用溴甲酚绿作指示剂）的大小， 抗生素抑制圈的大小， 指示菌生长圈的大小（测定生长因子产生）， 纤维素酶对纤维素水解圈（用刚果红染色）的大小， 外毒素的沉淀反应圈的大小等， 均可为初筛工作中估计某突变株代谢产物量的“形态”指标。,（7）设计高效筛选方案,设计简便、高效的科学筛选方案。,初筛,筛选工作,复筛,以量为主（选留较多有生产潜力的菌株）,以质为主（对少量潜力大的菌株的代谢产物量作精确测定）,常用的筛选方案,第一轮：,第二轮：,第三轮： 同第二轮 第四轮： 同上 . . .,直至获得较满意的结果为止,初 筛,复 筛,对产量突变株生产性能的测定方法,粗测为主,在培养皿平板上,在摇瓶中,（8）创造新型筛选方法(略),较精确的测定,摇瓶培养or台式自控发酵罐培养,3. 3类突变株的筛选方法 （1）产量突变株的筛选,1971年，国外有人报道了筛选春日霉素（kasugamycin，即“春雷霉素”）生产菌时所采用的一种琼脂块培养法，一年内曾使该抗生素产量提高10倍。,此法的关键是用打孔器取出含有一个小菌落的琼脂块作分别培养。这样，各琼脂块所含养料和接触空气面积基本相同，且产生的抗生素等代谢产物不致扩散出琼脂块外。 数据精确，效率高,（2）抗药性突变株的筛选,基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。,特点：,正选择标记 （突变株可直接从抗性平板上获得-在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。）,梯度平板法（gradient plate）是定向筛选抗药性突变株的一种有效方法，通过制备琼脂表面存在药物浓度梯度的平板、在其上涂布诱变处理后的细胞悬液、经培养后再从其上选取抗药性菌落等步骤，就可定向筛选到相应抗药性突变株。,梯度平板法（gradient plate） 是定向筛选抗药性突变株的一种有效方法。,（3）营养缺陷型突变株的筛选,营养缺陷型突变株（auxotrophic mutant）在生物学基础理论和应用研究以及生产实践上都有极其重要的意义。,a. 基本培养基（MM，符号为）, 与筛选营养缺陷型突变株有关的3类培养基,仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的组合培养基，称MM。,b. 完全培养基（complete medium，CM，符号为）,凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基，称为CM。,一般可在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素、核苷酸和碱基之类的天然物质，如蛋白胨或酵母膏等配制而成。,c. 补充培养基（supplemental medium，SM，符号为A或B等）,凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基，称为SM。,在基本培养基上再添加对某一营养缺陷型突变株所不能合成的某相应代谢产物所组成，可专门选择相应的突变株。,原养型（prototroph）, 与营养缺陷型突变有关的3类遗传型个体,野生型（wild type，wild strain）,营养缺陷型（auxotroph）,从自然界分离到的原始菌株（AB）,经诱变剂处理后的突变株（AB）,经回复突变或重组后产生的菌株（AB）, 营养缺陷型的筛选方法,第一步，诱变剂处理 第二步，淘汰野生型 第三步，检出缺陷型 第四步，鉴定缺陷型,淘汰野生型: 有没有选择性培养基：野生型不生长，缺陷型生长 MM 野生型生长，缺陷型不生长 孢子 菌丝体 过滤、离心,青霉素法(细菌）,MM+青霉素 诱变菌悬液 野生型生长 死亡 缺陷型生长 幸存 CM 结果：无菌生长,第三步，检出缺陷型,夹层培养法（layer plating method） 限量补充培养法 逐个检出法 影印平板法,逐个检出法,影印平板法,第四步，鉴定缺陷型,借助生长谱法（auxanography）进行。,1. 营养缺陷型（auxotroph）,某一野生型菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物（precursor）才能正常生长繁殖的变异类型，称为营养缺陷型。,营养缺陷型突变株 在遗传学、分子生物学、遗传育种和遗传工程等研究中 十分重要,表型判断的标准：,在基本培养基上能否生长,营养缺陷型的表示方法：,基因型：,所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：hisC （组氨酸缺陷型，其中的大写字母C同一表型中不同基因的突变）,表型：,同上，但第一个字母大写，且不用斜体：HisC,2. 抗性突变型（resistant mutant）,指野生型菌株因发生基因突变，使菌株对对某化学药物或致死物理因子，特别是抗生