细胞器的分离纯化实验.ppt

细胞器的分离、纯化 细胞分级分离法,秦川,实验目的,实验原理,实验用品,实验方法,应用范围： 1.病毒及亚细胞 组份分离 2.蛋白梯度分离 3.脂蛋白分离 4.RNA梯度沉淀 5.质粒DNA提纯,Back,实验目的,Back,实验原理,离心技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颖粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物质分离的分离分析技术。 细胞分级分离式一种通过离心从而分离细胞内不同结构成分的细胞器。不同的细胞器的大小和密度不同，在同一离心场内的沉降速度不同，用差速离心法、密度梯度离心法、密度梯度平衡离心法分离细胞器。 差速离心法是从低到高不同的转速离心，使较大的颗粒先在低转速中沉淀，再用较高转速将原来悬浮的小颗粒物质沉淀下来，从而达到逐级分离。,相对离心力（RCF） 由于转头有不同的制造商制造，半径不同，故用相对离心力来表示离心力的大小。 RCF (g) = Fc/F重力 = mG/mg = r2/g = 1.11910-5N2r =11.2r(N/1000)2 也有： 根据这个公式，相对离心力（RCF）和每分钟转数（N）之间便可以互换，这种互换关系是很有实用价值的。,Back,为了简便,实验用品,材料：新鲜菠菜 器材： 显微镜、高速低温离心机、普通离心机、离心管、200目的尼龙网、漏斗、烧杯、组织研磨器。 试剂： 线粒体离心匀浆介质。 1%詹纳斯绿B的0.25M蔗糖溶液。 0.05M Tris-HCl液体 Ph=8.0 0.35mol/L NaCl,Back,匀浆介质，一般为一定浓度的蔗糖溶液加入其它离子成分，可以维持亚细胞组分的渗透压。,台式高、超速离心机 0.6-10万rpm,离心机,制备性,分析性,分析性超速离心机,普通离心机,冰冻离心机,台式（或地面式）普通离心机,大容量冰冻离心机 小于0.6万rpm,高速冰冻离心机 0.6-2.5万,超速冰冻离心机 2.5-8万或更高,(分析性超速离心主要用于检测大分子物质的沉降特征和结构等),概述,Back,！,离心机一般由离心机主机，转头，离心管三部分组成。,离心机一般由离心机主机，转头，离心管三部分组成。,Back,一般制备离心,一般制备离心是指在分离、浓缩、提纯样品中，不必制备密度梯度的一次完成的离心操作，实验室用低、高速离心机可应用于此项技术。,台式或地面式普通离心机,Back,高速冰冻离心机,Back,从低速到高速逐级沉淀分离，使较大的颗粒先在较低转速中沉淀，再用较高转速将原先悬浮在上清液中的较小颗粒分离沉淀下来，从而使各种亚细胞组分得以分离。 差速离心法主要用于分离细胞器和病毒。 其优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。 缺点是：分离效果差，不能一次得到纯颗粒；壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。,细胞器沉降顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、核蛋白体。,差速离心法：,Low speed,High speed,差数离心法,Back,密度梯度离心法： 用具有梯度的介质来替换离心管中密度均一的介质，使介质分为不同的层次，浓度低的在上层，高的在底层。细胞匀浆加在最上层，随后离心。这样，不同大小、形态、密度的颗粒，就会以不同的速度向下移动，击中到不同的区域，可以分别收集。 该法的优点是：分离效果好，可一次获得较纯颗粒；适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。 缺点： 离心时间较长；需要制备梯度；操作严格，不宜掌握。,Back,将离心机转数换算为相对离心力时， 首先，在 r标尺上取已知的半径和在 N 标尺上取已知的离心机转数。 然后，将这两点间划一条直线，在图中间 RCF标尺上的交叉点即为相应的相对离心力数值。 注意，若已知的转数值处于 N 标尺的右边，则应读取 RCF 标尺右边的数值；同样，转数值处于 N 标尺左边，则读取 RCF标尺左边的数值。,半径,相对离心力,转速,方法： 两点一线法,Back,应急处理： 如果离心时发现离心管破裂，必须先停止实验，将破裂管密封放入生物垃圾桶，再用75%酒精进行擦拭消毒，如必要需用移动紫外灯照射3060分钟后才能开始实验。 注意事项： a）离心机应始终处于水平位置，与外接电源电压匹配，并要求有良好的接地线。 b）开机前应检查机腔有无异物掉入。注意事项： c）样品应预先平衡，使用离心机微量离心时离心套管与样品应同时平衡。 d）挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不外漏以免侵蚀机腔或造成事故。 e）每次操作完毕，应做好使用情况记录，应定期对机器各项性能进行检修。 f）离心过程中若发现异常现象，应立即关闭电源，报请有关技术人员检修。,Back,玉米黄化幼苗线粒体的分离（整个过程保持在0-4） 1.将玉米黄化幼苗剪下，称重每小组约5g，在冰箱中放置1小时 2.将幼苗剪碎直接倒入研钵中以1:3(重量体积比g:ml)比例加入离心匀浆介质，快速研磨，注意先加入少许介质液，研碎后将余液加入 3.用双层尼龙网过滤，除去残渣。 4.取滤液在低温高速离心机伤2300rpm离心10min弃沉淀 5.取上清液在低温高速离心机上9950rpm离心10min弃上清液 6.所留沉淀用匀浆介质液洗涤，以9950rpm离心10min弃上清 7.将所得沉淀悬浮于0.5M，ph=7.2甘露醇中，至于冰箱备用。 8.将制备的线粒体悬液滴于干净的载玻片上用1%詹纳斯绿B的0.25M蔗糖液（ph=7.4）染色20min 9.加干净的盖玻片。镜检最好用相差显微镜，所有的线粒体都被染成蓝绿色颗粒，检验制备的线粒体的纯度,实验方法,菠菜叶叶绿体的分离（整个过程保持0 ） 1取去叶脉的的新鲜菠菜叶5g于研钵中，加入0.35mol/L NaCl溶液15ml研磨。注意开始研磨时也是先加入少许介质，研磨后加入余液 2绿色的匀浆液用尼龙网过滤，滤液分别转入两支干净的