邻苯三酚自氧化法测定不同蜂产品抗氧化活性的研究.pdf

N o . 4 . 2 0 0 8 邻苯三酚自氧化法测定不同蜂产品 抗氧化活性的研究 玄红专,桑青,麻建军 (聊城大学生命科学学院,聊城2 5 2 0 5 9) 摘要:以蜂胶、蜂花粉、蜂王浆、蜂蜜为材料,利用邻苯三酚自氧化法分别测定和比较了1 %蜂胶 醇提液、5 %蜂花粉醇提液、1 0 %蜂王浆醇提液、1 0 %蜂蜜醇溶液对超氧阴离子自由基( O 2) 的清除效果。 结果表明,4种蜂产品对超氧阴离子自由基( O 2) 均有较好的清除效果,随着样品加入量的增多清除效 果也越强,并呈现量效关系,但加入相同样品量时,表现为1 %蜂胶醇提液和5 %蜂花粉醇提液清除效 果最好,1 0 %蜂王浆醇提液、1 0 %蜂蜜醇溶液次之。说明蜂胶、蜂花粉、蜂王浆、蜂蜜都能清除人体 内过多的超氧阴离子自由基( O 2) ,其中蜂胶和蜂花粉清除效果最好,是很好的抗氧化食品。 关键词:蜂胶;蜂花粉;蜂王浆;蜂蜜;邻苯三酚自氧化法 中图分类号:S8 9 6 文献标志码:A文章编号:1 0 0 5 - 9 9 8 9 ( 2 0 0 8 ) 0 4 - 0 1 3 7 - 0 3 A n t i - o x i d a t i o ns t u d yo f d i f f e r e n t b e ep r o d u c t sme a s u r e db y p y r o g a l l o l a u t o x i d a t i o nme t h o d X U A NH o n g - z h u a n , S A N GQ i n g , MAJ i a n - j u n ( S c h o o l o f L i f eS c i e n c e , L i a o c h e n gU n i v e r s i t y , L i a o c h e n g2 5 2 0 5 9 ) A b s t r a c t :T h ea n t i - o x i d a t i o ne f f e c t o f 1 % e t h a n o l e x t r a c t o f p r o p o l i s , 5 % e t h a n o l e x t r a c t o f b e ep o l l e n , 1 0 % e t h a n o l e x t r a c t r o y a l j e l l ya n d1 0 % e t h a n o l e x t r a c t b e eh o n e yw e r eme a s u r e da n dc o mp a r e db yme t h o do f p y r o g a l l o l a u t o x i d a t i o nme h t o d .T h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h e s ef o u r d i f f e r e n t b e ep r o d u c t sw e r ea l l g o o da n t i - o x i d a t i o np r o d u c t s , a n dt h er e mo v i n gs u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l ( O - 2) a b i l i t yo f 1 %e t h a n o l e x t r a c t o f p r o p o l i sw a s b e s t ,t h en e x t w a s5 %e t h a n o l e x t r a c t o f b e ep o l l e n ,t h ea b i l i t i e so f b e eh o n e ya n dr o y a l j e l l yw e r en ob e t t e r t h a no f p r o p o l i sa n db e ep o l l e n . I na d d i t i o n , t h er e mo v i n gs u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l a b i l i t yo f d i f f e r e n t b e e p r o d u c t ss h o w e dad o s e - r e s p o n s er e l a t i o n s h i p . I t c o u l db ec o n c l u d e dt h a t p r o p o l i sa n db e ep o l l e nw e r eb e t t e r a n t i - o x i d a t i o np r o d u c t st h a nt h a t o f r o y a l j e l l ya n db e eh o n e y . K e yw o r d s :p r o p o l i s ; b e ep o l l e n ; r o y a l j e l l y ; h o n e y ; t h eme t h o do f p y r o g a l l o l a u t o x i d a t i o n 蜂胶、蜂花粉、蜂王浆、蜂蜜是药食兼用的天 然绿色食品,具有广泛的生物学活性,如抗肿瘤、 抗氧化、抗辐射、抗病源微生物、抗菌消炎、增强 免疫、软化血管、净化血液、改善微循环、局部麻 醉、护肝、促进组织再生以及延缓衰老等广泛的生 物学作用 1 - 5 。 蜂胶、蜂花粉、蜂王浆、蜂蜜对超氧阴离子自 由基清除作用及清除机理不同。文献中对蜂胶 6 和蜂 花粉对超氧阴离子自由基清除作用研究较多,但是 对蜂王浆、蜂蜜清除超氧阴离子自由基效果的研究 不多见,并且4种蜂产品之间清除超氧阴离子自由 基效果的比较研究更不多见。本课题旨在比较蜂胶、 蜂花粉、蜂王浆、蜂蜜的对超氧阴离子自由基清除 效果,为今后蜂胶、蜂花粉、蜂王浆、蜂蜜应用于抗 收稿日期:2 0 0 7 - 0 8 - 2 9 基金项目:聊城大学科研基金项目( X 0 6 1 0 2 3 )。 作者简介:玄红专( 1 9 7 8),女,山东泰安人,硕士,讲师,主要从事天然产物的研究与开发工作。 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 提取物与应用 1 3 7 N o . 4 . 2 0 0 8 时间/ s03 06 09 01 2 01 5 01 8 0 吸光度A 10 . 2 1 6 0 . 5 7 6 0 . 7 7 60 . 8 7 20 . 9 3 4 0 . 9 7 0 0 . 9 9 1 表1邻苯三酚自氧化速率 氧化方面提供理论依据,并指导人们正确的选择具 有抗氧化活性的蜂产品。 1材料与仪器 1 . 1材料 油菜花粉、茶花花粉、蜂胶、枣花蜜、蜂王浆: 市售;无水乙醇;邻苯三酚;T r i;H C l;其他试剂: 分析纯。 1 . 2实验仪器 C U 4 2 0型恒温水浴锅:上海恒科科学技术有限 公司;F A 1 6 4 0型电子天平:上海天平仪器厂;8 5 - 1 型恒温磁力搅拌器:常州国华仪器有限公司;T D L - 6 0 B型离心机:上海安亭科学仪器厂;7 2 3型可见分 光光度计:上海第三分析仪器厂;2 0 2 - 1 A型数显电 热恒温干燥箱:上海阳光实验仪器有限公司。 2实验方法 2 . 1试剂的配制 1 0m m o l / LH C l的配制:取0 . 9m L盐酸用蒸馏水 定容至1 0 0 0m L。 5 0m m o l / Lp H8 . 2T r i s - H C l缓冲液的配制:先配 成0 . 1m o l / LT r i s溶液,再取1 0m m o l / LH C l溶液混 合,调p H值至8 . 2。 3m m o l / L邻苯三酚溶液的配制:用1 0m m o l / L H C l溶液溶解定容至1 0 0 0m L,再取1 0 0m L此溶液 定容至1 0 0 0m L即可。 2 . 2样品液的制备 2 . 2 . 1 1 %蜂胶样品液的制备蜂胶醇提液的制备: 由于粗蜂胶中含有大量的杂质,需要提纯,纯蜂胶 制备工艺流程如下:粗蜂胶冷冻( 2 4h)粉碎 9 5 %乙醇提取3 6h 过滤滤液浓缩干燥。 1 %蜂胶样品液的制备:准确称取1 . 0 0g蜂胶提 取物,用8 0 %的乙醇溶解定容至1 0 0m L,移入试剂 瓶中,低温贮藏,备用。 2 . 2 . 2 5 %蜂花粉样品液的制备准确称取油菜花粉、 茶花花粉各1 . 0 0g,加入2 0m L8 0 %乙醇,用保鲜膜 覆盖试管口,5 0水浴加热1 0h,其间摇匀试管数 次以提高提取率,最后将上述粗提物6 0 0 0r / m i n离心 3 0m i n,上清液即为所需的5 %蜂花粉样品液,低温 贮藏,备用。 2 . 2 . 3 1 0 %蜂王浆样品液的制备准确称取蜂王浆 2 . 0 0g,放入5 0m L的小烧杯中,加入2 0m L8 0 %乙 醇,用玻璃棒搅拌促其溶解,然后取上述悬浊液 6 0 0 0r / m i n离心3 0m i n,上清液即为所需的1 0 %蜂王 浆样品液,低温贮藏,备用。 2 . 2 . 4 1 0 %枣花蜜样品液的制备准确称取枣花蜜 2 . 0 0g,放入5 0m L的小烧杯中,加入2 0m L8 0 %乙 醇,用玻璃棒搅拌促其溶解,即为所需的1 0 %蜂蜜 样品液,低温贮藏,备用。 2 . 3抗氧化实验原理 利用某些体系在氧化过程中有超氧阴离子自由 基( O 2) 的生成,O 2与某些化合物的作用,产生具有特 定吸收的有色物质,利用分光光度计进行测定。受试 物若能清除O 2,则吸光度发生变化,可间接判断受 试物对O 2的清除作用。 邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化,自氧化过 程中产生O 2,O 2又加速邻苯三酚自氧化速率,同时 产生有色中间物质,有色中间产物的积累在滞后3 0 4 5s与时间成良好的线性关系,一般维持4m i n,随 后减慢。有色中间产物在3 2 2n m有强烈的光吸收。 由于自氧化的速率依赖于O 2的浓度,消除O 2则抑制 自氧化反应,阻止中间产物的积累,从而评价受试物 清除O 2的能力 7 - 8 。 2 . 4具体操作 2 . 4 . 1邻苯三酚自氧化速率的测定取4 .5 m L 5 0 m m o l/L T r i s - H C l缓冲溶液( p H 8 . 2) 、4 . 2m L蒸馏水在2 5 m L的 试管中混匀后在3 7水浴中保温2 0m i n,取出后立 即加入在3 7预热过的3m m o l / L邻苯三酚0 . 5m L, 迅速摇匀后倒入比色皿,3 2 5n m下每隔3 0s测定吸 光度,计算线性范围内每分钟内吸光度的增加,以1 0 m m o l / L H C l溶液配制空白管作为对照,记录结果。 2 . 4 . 2加入样品液后邻苯三酚自氧化速率的测定 按照上述步骤在加入邻苯三酚前先分别加入0 . 1、 0 . 2、0 . 3、0 . 4、0 . 5m L的各样品液,蒸馏水相应减少。 同样以1 0m m o l / LH C l溶液配制空白管作为对照。测 定吸光度,每个样品均重复3次,取其平均值。 2 . 4 . 3计算清除率 抑制率( %) = ( A 1/ t - A2/ t )/ ( A 1/ t ) 1 0 0 式中:A1/ t为邻苯三酚自氧化时反应速率; A2/ t为加入样品液后邻苯三酚自氧化 时反应速率。 3结果与分析 3 . 1邻苯三酚自氧化速率 每隔3 0s所测邻苯三酚自氧化速率吸光值结果见 表1。由表1可知,邻苯三酚自氧化速率 A 1/ t = 4 . 3 1 1 0 - 3 。 3 .2蜂胶、茶花粉、油菜花花粉、蜂王浆、枣花蜜样品 液清除超氧阴离子的效果比较 1 %蜂胶、5 %茶花粉、5 %油菜花花粉、1 0 %蜂王浆、 1 0 %枣花蜜样品液对超氧阴离子自由基( O 2) 清除率的 提取物与应用 1 3 8 N o . 4 . 2 0 0 8 比较见表2。 由表2可知,不同蜂产品对超氧阴离子的清除 率不同。 对于蜂胶而言,其对超氧阴离子自由基( O 2) 的 清除率最高,而且随着蜂胶样品液加入量的增加, 对超氧阴离子自由基的清除率也随之增加,说明蜂 胶具有较强的活性,具有较好的抗氧化活性。 对于5 %油菜花粉,随着样品液加入量的增加, 对超氧阴离子自由基的清除率也随之增加,呈量效 关系,并且清除率维持在较高水平,说明油菜花花 粉具有较强的清除超氧阴离子自由基( O 2) 活性,具有 较好的抗氧化活性。 对于5 %茶花粉,随着样品液加入量的增加,对 超氧阴离子自由基的清除率也随之增加,呈量效关 系,并且清除率维持在较高水平,说明茶花粉具有 较强的清除超氧阴离子自由基( O 2) 活性,具有较好 的抗氧化活性,但其清除率比5 %油菜花粉低。 对于1 0 %蜂王浆,随着样品液加入量的增加, 对超氧阴离子自由基的清除率缓慢增加,清除率在 1 4 %。 对于1 0 %枣花蜜,随着样品液加入量的增加, 对超氧阴离子自由基的清除率也随之增加,但清除 率在1 3 . 5 %,具有一定抗氧化活性,但比蜂胶、油菜 花粉、茶花花粉清除率要低,跟1 0 %蜂王浆对超氧 阴离子自由基( O 2) 的清除率相当。 4讨论 从本实验结果可以看出,蜂胶、蜂花粉、蜂 王浆、蜂蜜4种蜂产品中,蜂胶对超氧阴离子自由 基( O 2) 的清除率最高,而蜂花粉次之,而蜂花粉中, 油菜花粉的清除率比茶花花粉略高,蜂王浆、蜂 蜜也均有抗氧化活性,表明这4种蜂产品都是很好 的抗氧化保健食品。该实验中得到蜂王浆对超氧 阴离子自由基( O 2) 的清除率不高,其根本原因可能 跟蜂王浆的质量以及放置时间有关,因为本实验 所用蜂王浆已经放置一年,可能影响到蜂王浆的 活性。 蜂胶、蜂花粉、蜂王浆、蜂蜜是4种不同的 蜂产品,它们的化学组分不尽相同,其抗氧化的 机理不同,但主要跟4种蜂产品中含有丰富的具 有抗氧化作用的物质有关,如黄酮类、酚类、萜 烯类化合物,不饱和脂肪酸,V A、VE、VC、胡萝卜 素及微量元素锌、硒、铜、锰等综合协同作用的 结果。由于本实验室仪器设备有限,对于蜂胶、蜂 花粉、蜂王浆、蜂蜜4种蜂产品的抗氧化活性机 制是否相同没有进一步的探讨,今后应加强这方 面的研究。 参考文献: 1 胡福良,玄红专.蜂胶的生物学活性及毒性和过敏反应.科 技通报, 2 0 0 3 , 1 9 ( 2 ) : 1 6 6 - 1 6 9 2 潘建国,郑尧隆,刘远红.试论蜂花粉中的功能因子.中国 自然医学杂志, 2 0 0 1 , 3 ( 3 ) : 1 6 2 - 1 6 3 3 茹清静.蜂王浆活性成分与护肝机制研究.中西医结合肝 病杂志, 2 0 0 2 , ( 6 ) : 3 8 1 - 3 8 3 4 倪辉,吉挺,杨远帆.蜂王浆抗菌作用的初步研究.蜜蜂杂 志, 2 0 0 3 , ( 2 ) : 9 - 1 0 5 朱威,胡福良.蜂蜜抗菌特性在医药上的应用.蜜蜂杂志, 2 0 0 3 , ( 8 ) : 2 3 - 2 4 6 张燕平.天然蜂胶对自由基的清除作用.食品与发酵工业, 2 0 0 2 , 2 8 ( 1 ) : 4 8 - 5 2 7 赵新合.油菜和荷花蜂花粉提取物的抗氧化研究.应用化 学, 2 0 0 5 , ( 8 ) : 5 0 0 - 5 0 4 8 张海容.沙棘多糖和黄酮清除氧自由基的研究.化学通报, 2 0 0 6 , ( 6 ) : 2 5 - 3 0