课件：男性不育的试验室诊断及评价南京医科大学.ppt

男性不育的实验室诊断及评估,南京医科大学生殖医学重点实验室 周作民,维持男性生育的基本条件： （1）睾丸内产生足够数量的精子。 （2）精子在男性生殖管道内获得运动能力和 受精能力，既精子的成熟。 （3）输精管道通畅。 （4）具有正常的性功能。 （5）附属性腺功能正常。,不育症诊断的步骤： 1. 病史采集: 包括年龄、职业、生育史、疾 病史、家族史等。 2. 体格检查：包括外生殖器和全身体检。 3. 实验室诊断 4. 特殊检查,一、 精液常规分析 精子（5%） 精液组成 精囊腺液（60%）凝固因子、果糖 精浆（95%）前列腺液（20%）液化因子 尿道球腺液（3%） 睾丸液、附睾液 精子,精液分段成分： 前段睾丸液，附睾液（精子），尿 道球腺液 中段前列腺液 后段精囊腺液,精液变量的参考值： 精液量：26ml 颜色：灰白 液化时间：60% 活力： A+B50%或A25% 精子计数：2000万/ml 畸形率：30% 脓细胞： 5个/HP （1106/ml),精子活力分级 A 级：快速前向运动 B 级：慢或呆滞的前向运动 C 级：非前向运动 D 级：不动,影响精液常规数据准确性的因素： 自身的波动性: 要求首次检查应连续进行两次,间隔时间7 天3周，两次结果差异大时应再检一次。,每周测定一次精子密度，连续120周，期间此人未服药，也无发热，结果显示精子密度可有显著性波动。, 禁欲时间： 要求2天 采精方式： 要求用手淫法或取精器取精。 盛精容器： 要求用对精子无毒性的玻璃或塑料容器。 室温： 要求不低于20度 观察时间： 要求精液液化后，取精后1小时内检测。 检测设备： 冬天检测应注意保温。,精液常规异常的分析： 1. 精液量异常 1) 无精液症：精液量6ml 病因：附属性腺感染 附属性腺功能亢进,2. 精液液化及粘稠度异常 精液不凝固或凝固不全：精液稀薄，流动性大。 病因：精囊腺炎症 精液不液化或液化不全：液化时间30分 病因：前列腺功能障碍,3. 精液pH异常： 测量方法：pH试纸(pH范围6.1-10.0 或6.4-8.0) pH过低：pH7.2 原因：输精管和精囊腺的缺如 附睾病变 pH过高： 原因：精囊腺液分泌过多 前列腺液分泌过少,4. 精子记数异常： 正常20106个/ml 测定方法：血球计数板 一次性精子计数板 Makler精子计数板 CASA仪 1) 少精子症：250106个/ml,5. 精子畸形： 观察方法：吉姆萨染色法或瑞士染色法 巴氏染色法 布赖恩利什曼染色 肖尔染色法 畸形分类：头部畸形：大头，小头，锥形头，梨形头， 无定形头，空泡样头，双头等。 颈和中段畸形：缺尾，弯曲尾，肿胀，过薄等。 尾部畸形：短尾，多尾，断尾，卷尾，双尾等 胞质残余体：常位于精子颈部,白细胞检查： 正甲苯胺蓝过氧化酶染色法： 结果：白细胞染成棕红色 联苯胺法：染料：联苯胺玫瑰红 结果：白细胞褐色；其它细胞品红色。,二精子运动特性的检测和分析 1. 显微镜观察： 注意事项： (1)取精液10 ul，滴于玻片，盖上2222盖玻片，静置1 分钟后观察。 (2) 控制温度，最好在37进行 (3) 每次观察46个视野，计算100个细胞，计算A级、 B级、C级和D级精子的百分比，连续观察两张滴片， 误差不得10%。,2. 多点曝光技术：在1秒钟内对精子连续曝光6次，可判断精子的运动速度及运动轨迹。 精子运动速度分布： 快速： 25微米/秒 中速： 1025微米/秒 慢速：10 微米/秒,3. 计算机辅助的精子分析系统（CASA） 原理：用高分辨率摄像机实时记录精子及精子运动图象， 用分析软件对图象进行处理和分析，并得出结果。 硬件：显微镜，摄像机，微机 软件：图象分析系统,参数及意义： 1) 运动精子密度：活动率 前向运动率 2) 活力参数：平均路径速度 曲线速度 直线速度,不足之处： 价格高 误判多：特别是脱落细胞多时 不能识别畸形精子、脓细胞 对待检标本的精子密度有一定要求：精子数量少时， 计数偏高，精子数量高时，活率偏高。,宫颈粘液穿透试验： 1) 体内试验：性交后试验（PCT） 注意事项：排卵期进行 禁欲至少2天 最好在性交后924小时进行观察。 诊断标准：正常为宫颈粘液中的活动精子数50个/HP或 A级精子20个HP,影响因素：女方的内分泌状况。 宫颈粘液中的白细胞。 阴道pH，8.5可导致PCT异常。 宫颈结构异常。 抗精子抗体影响。 性功能异常,如阴道痉挛。 精子质量差。,2) 体外试验： 玻片试验 精子宫颈粘液接触试验 毛细管试验: 穿透介质: 人宫颈粘液; 宫颈粘液代用品: 牛宫颈粘液; 含人血清精子营养液; 含牛血清白蛋白精子营养液; 鲜鸡蛋清;,精子顶体酶测定（明胶膜法）： 1) 制备5%明胶溶液，吸取100ul均匀涂于载玻片上，自然干燥，4湿盒备用，使用前用甲醛酒精固定液固定60分钟。 2) 精子处理：取液化精液，用PBS稀释至24106个/ml。 3) 涂片：取1滴精液涂于明胶膜上，37湿盒2小时。 4) 观察：于相差显微镜下计数有反应精子的百分率及精子的平均反应直径。 5) 正常值：平均反应率65%，平均反应直径25m。,6去透明带仓鼠卵穿透试验 1) 精子准备： 精液充分液化 调整精子浓度至10106个/ml 精子获能：取精液0.5ml，5%CO2，95%空气中， 37孵育1824小时，调整精子浓度至4106/ml。,2) 卵细胞准备： 取动情第一天仓鼠，腹腔内注射PMSG 3040U，4872 小时后再次注射HCG 3040U，18小时后输卵管内取卵。 1%透明质酸去除卵丘细胞，0.1%胰蛋白酶去除透明带。 3) 体外受精： 将0.1ml精液加至液体石蜡下，再加入2030个仓鼠卵，培养3小时。 4) 结果观察： 相差镜下见卵丘细胞内膨大的精子头为受精卵，计算受精率，正常为10%。,三精液生化指标检测 1. 酸性磷酸酶测定（ACP） 原理：P硝基酚磷酸二钠 ACP P硝基酚 测定产生的P硝基酚含量，推测ACP的活性 正常值：200U一次射精 意义：反映前列腺功能,2. 果糖测定：间苯二酚法 原理：果糖间苯二酚 加热 红色化合物 测定化合物含量 正常值：0.873.95g/L 意义：反映精囊腺功能与精子供能有关 3. 糖苷酶测定 原理：麦芽糖 糖苷酶 葡萄糖 测定葡萄糖含量 正常值：35.187.7U/ml 意义：反映附睾功能,四抗精子抗体测定 1. 常用方法： 1) 凝集试验： 原理：大分子或多价抗体如IgM或分泌型IgA可以在精子间形成交链，产生精子凝集，观察。 试管玻片凝集试验（FramRlin-Dukes）： 将待检样本与液化的精液混合后，于孵育小时，显微镜下观察，出现条以上精子头头、尾尾或头尾连接即为凝集，观察个视野，个以上出现凝集即为阳性。 圆盘凝集试验（Friberg） 凝胶凝集试验（Kibrick） 缺点：假阳性高,2) 精子制动试验（Isojima）： 原理：在补体参与下，精子表面的抗精子抗体可抑制精子的运动能力。 缺点：敏感性差，IgA的作用常测不出，吸附于精子头部的AsAb作用也常常测不出。,3) 直接免疫荧光试验： 原理：用荧光素标记抗人免疫球蛋白抗体与精子混合后，如精子表面有抗体，则标记的二抗吸附于精子表面，出现荧光。 优缺点：方法敏感，假阴性少，且可确定吸附部位，但假阳性多。 4) 免疫珠试验： 原理：将聚丙烯珠与兔抗人免疫球蛋白相连，如精子表面有抗精子抗体，则免疫珠与精子表面吸附，光镜下即可观察到，计数吸附在免疫珠上的活动精子数，计算百分比，且可确定吸附部位。 优缺点：结果可靠，且可进行抗体分类和定位，但价格较贵。,5）混合抗球蛋白抗体试验（MAR试验）： 原理：将精液与包被了IgG或IgA的乳胶颗粒或红细胞混合，在加入二抗，颗粒与活动精子间形成混合凝集预示精子表面存在IgG或IgA.,6) 酶联免疫吸附试验（ELISA）： 原理：将精子抗原吸附于酶标板上，加入待检样本，如有AsAb则吸附于精子抗原上，加入酶标二抗，与AsAb结合，最后加入底物，产生颜色反应。 优缺点：可大规模使用，但有假阳性和假阴性，必须设定阳、阴性对照。,五激素测定 六遗传检测 （一）染色体检查 染色体的非整倍体 ）性染色体的非整倍体 精子发生需要性染色体的平衡，即一个X和一个Y，X或Y的数目异常均可导致精子发生异常。,(1) 47,XXY男性（Klinefelters syndrome），发生率1：500，睾丸发育不良，精子发生障碍；46,XY/47,XXY亦经常发生，伴有无精子或少精子。 (2) 48,XXXY，49,XXXXY表型为女性，阴茎发育不良，隐睾。 (3) 46,XX男性：由于Y染色体的短臂（Yp11）异位到X染色体的短臂上（Xp22）。内生殖器表现型取决于Yp11的断裂部位，Yp11远端（SRY附近）的断裂常导致隐睾、小阴茎、尿道下裂。 (4) 45,X男性，较少见，为Y长臂缺失，短臂异位至常染色体上（13,15,22常见）。 (5) 47,XYY发生率1：750，活检显示曲精小管受损，生精阻滞于精母细胞阶段，有时有精子生成。少数人能生育，但胚胎易死亡，或后代有异常染色体，4575%精母细胞带有二个Y。 (6) YA平衡异位：Y长臂远端的异染区（Yq12）转移至端着丝粒常染色体的长臂上，Y长臂断裂在Yq11上，断裂部位对精子发生的影响较大，距Yq11较近时，精子发生基因受损，致精子发生障碍。断裂距Yq11较远时，精子发生可正常并能生育，但带有YA异位的很易再断裂而引起不育，或将异位传给子代，使子代发生断裂而导致精子生成障碍。,2) 常染色体的非整倍体 在不育男子中，常染色体结构异常的发生率是有生育能力男子的10倍。 (1) 男性Turner氏综合征（Noonan 综合症）： 为常染色体显性或隐性遗传病，染色体核型常为46, XY，或XO/XY嵌合体。 临床表现：身体矮小，颈蹼，典型的脸部特征，心脏缺陷，隐睾，无精子或少精子症，血睾酮下降，FSH和LH升高。 21三体（Down 综合症）：可生育或不育，多余的一条21可影响联会复合体的形成，也可影响性染色体上性泡（Sex vesicle）的形成。 、3、9、10染色体长臂的部分三体或单体可引起性翻转，性腺退化，生精障碍。 罗伯逊异位：无精子症患者可见，但常引起严重少精子症。,体细胞和生精细胞内的染色体异常可能不一致。已发现1号染色体的非整倍体和XY精子的发生率是体细胞的10倍，如用XY精子行ICSI则可产生47,XXY的后代。已有报道，ICSI的胚胎性染色体非整倍体的发生率高于自然生殖。因此对行ICSI的患者，最好进行精子的染色体分析或植入前胚胎的遗传分析。,（二）精子发生基因（Azoospermia factor, AZF）检测 1. AZF存在部位：Yq11.23 2. AZF的重要候选成分：YRRM1, DYS240, DAZ 3. AZF与精子发生的关系： 精子发生障碍患者中（无精子或精子计数小于500万ml）约有有AZF缺失,4. AZF的检测方法： (1) 染色体原位杂交法 (2) Southern Blot方法 (3) PCR方法：具有迅速、灵敏、操作简便和成本低等特点，便于临床推广应用，多重PCR可同时检测几AZF成分。 (4) 单链构象多态性分析（Single Strand Conformation analysis, SSCP）检测AZF的点突变。 (5) 核苷酸序列测定 (6) 基因芯片技术,5. AZF检测的意义： (1) 从基因水平揭示精子发生的机制。 (2) 无