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晋中学院生物科学与技术学院2014届毕业论文（设计） 晋 中 学 院 本科毕业论文（设计） 题 目 鲤鱼鱼皮胶原蛋白 提取工艺的优化 院 系 生物科学与技术 专 业 生物科学 姓 名 赵海燕 学 号 1010111243 学习年限2010年9月至2014年7月指导教师 霍建新 职称 副教授 申请学位 理学 学士学位 2014年5月27日鲤鱼鱼皮胶原蛋白提取工艺的优化学生姓名：赵海燕 指导老师：霍建新摘 要： 以鲤鱼鱼皮为原料，探索了用胃蛋白酶从鱼皮中提取胶原蛋白的制备技术。对提取过程中选取酶的用量，提取时间，pH值和温度这4个因子对胶原蛋白的提取率进行了比较详细的研究。然后通过正交试验，对实验结论进行讨论与对比，从而可以得出用胃蛋白酶提取鲤鱼鱼皮胶原蛋白的最佳条件是酶的加量为75Ug-1，提取时间是8h，pH值为2，提取温度为37。关键词：鲤鱼 胶原蛋白 酶法浸提 胃蛋白酶Study on Enzymatic Hydrolysis of Carp Skin Collagen Authors Name:Zhao Haiyan Tutor：Huo JianxinABSTRACT： The basic components of carp skin were determined in this study which explore the preparation technology of extracting collagen from carp skin by pepsin. The process variables were enzyme dosage, extraction time, pH and temperature. In the process of expracting, these four factors on the extaction rate of collagen were studied in detail, then through orthogonal experiment, the experimental conclusions are discussed and compared. Collagen hydrolysaces were first gained by pepsin for 8h at temperature(37),pH(2),enzyme dosage (75 u g 1).KEYWORDS：Carp Collagen Enzymatic extraction Pepsin目 录1 前言1 1.1 胶原蛋白的定义1 1.2 胶原蛋白的提取方法1 1.3 胶原蛋白的应用2 1.4 本文研究的内容42 鲤鱼鱼皮用酶法提取胶原蛋白的研究5 2.1 实验材料5 2.2 鲤鱼鱼皮的预处理5 2.3 鲤鱼鱼皮胶原蛋白的提取5 2.4 鲤鱼鱼皮提取胶原蛋白的单因素试验5 2.5 鲤鱼鱼皮胶原蛋白提取率的测定53 鲤鱼鱼皮用酶法提取胶原蛋白的结果与分析6 3.1 羟脯氨酸标准曲线的绘制6 3.2 胃蛋白酶的用量对胶原蛋白提取率的影响7 3.3 胃蛋白酶的提取时间对胶原蛋白提取率的影响8 3.4 pH值对胶原蛋白提取率的影响8 3.5 提取温度对胶原蛋白提取率的影响9 3.6 正交试验优化提取条件94 讨论105 结论11参考文献11致 谢13 晋中学院生物科学与技术学院2014届本科毕业论文（设计） 1 前言 1.1 胶原蛋白的定义 胶原蛋白（也称胶原）是细胞外基质的一种结构蛋白质，英文名“collagen”，由希腊文演化而来，多糖蛋白，呈白色，含有少量的半乳糖和葡萄糖，是细胞外基质（ECM）的主要成分，约占胶原纤维固体物的85%。 胶原蛋白是动物体中普遍存在的一种大分子蛋白，主要存在于动物的结缔组织（骨、软骨、皮肤、腱、韧等）中，占哺乳动物体内蛋白质的25%30%，相当于体重的6%。在许多海洋生物，如鱼类的皮，占其蛋白质含量甚至高达80%以上。 除了生物力学方面的以外，还具有诸如信号转导、生长因子与细胞因子的运输等功能。由于氨基酸组成方面的差异，使得鱼皮、鱼鳞、鱼骨中含有的胶原蛋白具有很多在陆生动物中含有的胶原蛋白中没有的特点，例如固定凝胶性、低的粘度性、高度分散性、吸水性、以及乳化性等等，另外人们发现来源于海洋动物的胶原蛋白在一些方面明显优于陆生动物的胶原蛋白，比如具有低的抗原性、低的过敏性、可溶性高、易被蛋白酶水解、变性温度低等特性1。因此从水产动物中提取胶原蛋白越来越成为一种新的趋势，具有很好的前景。胶原蛋白种类较多，常见类型为型、型、型、型和型，胶原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，比如低抗原性、在体内易被人体吸收、能促进细胞成活与生长、促进血小板凝结等在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛的应用2。它不仅可以作为保健食品、包装材料和美容产品、还能作为食品添加剂应用在冷冻食品、饮料、糕点和乳制品中。在医学领域中，由于胶原蛋白具有低的免疫原性、生物可降解性、强的机械性纤维和再形成性等优点，可制成人工皮肤胶、原海绵、胶囊等3。中国传统的胶原保健品“阿胶”主要是以驴皮为原料（其实就是驴皮中所含胶原蛋白），经特殊的工艺生产出来的，具有较高的滋补保健作用，有中药三宝之一的美誉。 1.2 胶原蛋白的提取方法胶原蛋白提取的目的就是尽量提高胶原蛋白的提取率，并且使所提取的胶原蛋白能够满足不同领域的要求。到目前为止，胶原的提取方法主要有以下3种：酸碱法、酶法、热水法4。 1.2.1 酸法提取 酸法主要通过采用低浓度酸性条件处理原料，从而破坏分子间的盐碱，而引起纤维膨胀、溶解。用的酸主要有盐酸、硫酸、醋酸、磷酸、柠檬酸和甲酸等15。用酸浸提法就是提取胶原蛋白十分有效的办法，因为用酸法提取的胶原蛋白能够最大程度的保持其结构。而且此法处理非常快速，所得到的产品分子量还是连续的，适用于医用生物材料和原料的制备，但是产品的得率低，设备腐蚀比较严重，污染严重。户业丽等比较了柠檬酸、醋酸和乳酸提取人工养殖鲟鱼皮胶原蛋白工艺，得出了用0.5M的柠檬酸提取鱼皮胶原蛋白的的率最高5。傅燕风等研究了用有机酸对几种淡水鱼皮进行了提取得出了鲢鱼皮、草鱼皮的酸提取以醋酸为最高，鳙鱼鱼皮以柠檬酸为最高6。 1.2.2 碱法提取碱法提取胶原蛋白比较常用的处理剂有石灰、碳酸钠、氢氧化钠等。如Holzer等采用1%1.5%石灰水浸泡的方法来提取胶原蛋白7。因为它容易造成肽键的水解，所以得到的水解产物就相当低。所以，若想保留胶原蛋白的螺旋结构，此方法不能进行。 1.2.3 热水法提取 热水提取法是将原料经过除杂蛋白等前处理之后，在一定条件下直接用热水浸提已经变性了的胶原蛋白或提胶原蛋白水解物，使用的温度有100沸水浴、60-70、40-458。 1.2.4 酶法提取 酶法提取是利用某一蛋白酶使胶原蛋白溶解，水解条件要温和，反应速率要快，这样提取的胶原蛋白就具有完整的三螺旋结构，而且纯度高，理化性质稳定，并且无环境污染。酶法提取常用的蛋白酶有：胃蛋白酶、胰蛋白酶。工艺既可以采取一步法，也就是利用酶液直接提取；也可以采取二步法，就是先用酸或者碱进行初步提取，然后再用酶提取。陈小娥等以安康鱼皮为原料，用胃蛋白酶提取胶原蛋白，采用正交试验得到了最佳工艺条件9。赵苍碧采用胃蛋白酶从牛腱中提取胶原蛋白，研究了酶和酶的用量对提取率的影响，从而算出了酶对胶原蛋白提取率的最佳工艺配比，当酶与牛腱的质量比为0.1时效果最好10。 1.3 胶原蛋白的应用 1.3.1 胶原蛋白在食品工业上的应用胶原蛋白已我国许多地区销售了多年，并已被确认为一种安全可靠的食品。除了用来生产保健产品，作为一种普通的食品胶原蛋白也有重要的应用。 在预防心血管病方面，研究表明，胶原蛋白能够降低胆固醇，并可以使体内某些微量元素维持在一个比较正常的范围内，从而降低血脂。此外，胶原蛋白还能够帮助机体排出有害物质，加速血红蛋白和红细胞生成，也可以改善血液循环，同时对冠心病、缺血性脑病有着重要的作用。 在作为为人体补钙方面，胶原蛋白作为补钙食品，不是直接补钙的，而是作为血浆中运输钙的工具。除此之外，骨细胞中的胶原蛋白也是黏合剂，它和磷灰石共同形成了骨骼的主体。研究已经表明，机体只有摄入足够多的胶原蛋白时，才能保证机体所补充钙不会流失。其中有一篇写了关于胶原蛋白的文章胶原蛋白可有效改善骨质疏松中特别详细的介绍了胶原蛋白与固钙的关系。在作为食品添加剂方面，胶原蛋白是一种很好的改良剂。当胶原蛋白水解后就形成松散的小分子，同时把它放到肉制品中改善结缔组织的嫩度，增加蛋白质的含量。MeuUenet等许多人的研究表明，腊肠中胶原蛋白的含量在2%，水在20%左右时，腊肠的外观和口感是最好的11。与其他蛋白质一样的是，胶原蛋白也具有染色性。根据制品的需要，可以用食用色素将腊肠染成接近于肌肉组织的桃红色，使消费者更容易接受。 在饮料和乳制品方面，鱼皮中的胶原蛋白是世界上公认的胶澄清剂，它在酒的酿造过程中可以起到增稠剂、乳化剂、稳定剂、澄清剂等等作用。在茶饮料的生产中，明胶可以防止茶饮料长期存放引起的混浊，改善茶饮料品质的目的。胶原蛋白在乳饮料、鲜牛奶、酸奶等乳制品中也有着广泛的应用，并在其中起到抗乳清析出、乳化稳定的功效。同时胶原蛋白也可以加到奶粉中，提高奶粉的营养价值，从而增强奶粉的功能性，加速骨骼发育、增强智力、提高机体的免疫力。 在糖果糕点方面，胶原蛋白添加至面包中可延长面包的老化时间，并可以提高面包的体积及面包的松软度。胶原蛋白也具有吸水和支撑骨架的作用，使其微粒溶于水后能相互交织成网状结构，提高糖果的营养价值，并可以开发出低热量的12。 在冷冻食品方面，胶原蛋白因其熔点比较低，易溶于热水中，具有入口即化的特点，所以常被用作粮食胶冻、餐用胶冻、果冻等等。在冰淇淋、雪糕等生产中，胶原蛋白也可以降低融化速度。 1.3.2 胶原蛋白在美容方面的应用胶原蛋白中含有许多的蛋白多糖，这些多糖中含有大量的极性基团，是保湿因子，可以阻止皮肤中的酪氨酸转化为黑色素，因此胶原蛋白具有保湿、美白、防皱、祛斑等的作用，可以更快的应用于美容产品中。随着年龄的增长，皮肤中就会缺乏胶原蛋白，皮肤就会失去柔软、弹性和光泽，发生老化，使皮肤出现色斑、皱纹等一系列现象。而将胶原蛋白应用在化妆品中，可以抑制黑色素的产生，同时可以促进皮肤组织的新陈代谢，对皮肤产生良好的美白保湿、消皱美容等的作用。 1.3.3 胶原蛋白在医学上的应用胶原蛋白是一种肌体自然蛋白，对皮肤表面的蛋白质分子具有比较大的亲和力、比较弱的抗原性、良好的生物相容性，粘着力好。由胶原制成的手术缝合线既有与天然丝一样的高强度，又有可吸收性，在使用时既有优良的血小板凝聚性能，止血效果好，所以胶原蛋白可以作为止血剂。同时用合成材料或胶原蛋白在血浆代用品、人造皮肤、人工血管、骨的修复和人工骨和固定化酶的载体等方面的研究和应用方面都十分的广泛。胶原蛋白分子肽链上具有多种反应基团，如羟基、羧基和氨基等，易于吸收和结合多种酶和细胞，实现固定化，它具有与酶和细胞亲合性好、适应性强的特点。另外，胶原容易加工成型，故纯化的胶原蛋白可制成许多不同形式的材料，如膜、薄片、带、海绵、珠体等，但是以膜形式应用的最多。胶原蛋白制备膜可以用于生物医学，除具有生物可降解性、生物相容性、组织可吸收性、弱抗原性外，还有抗张强度高，亲水性强，透水透气性好等特点，而且官能团多，可进行适度的交联改性，从而可以调节溶解性和控制其生物降解的速度，当同时与其它生物活性组分一起使用时，具有协同效应，也可以与药物相互交联或用酶处理端肽，这样可使抗原性降低，也可以隔离微生物而且还有生物活性13。同时也存在以下的缺点：胶原分离的胶原交联密度、纤维大小等具有多样性，胶原的分离纯化及加工处理也复杂。酶解胶原蛋白的条件难于控制，速度也多变，而且胶原蛋白干燥后质地也脆，成膜能力还并不强，其膜的延展性低，抗水性差，易干裂，在体内容易降解，遇到水后也容易溶胀，而且在潮湿的环境中易受细菌的侵蚀而变质，同时也可能会导致一些副作用，比如组织钙化等。因此在实际应用中，常常会通过一定的方法首先将胶原蛋白改性，然后提高胶原蛋白的拉伸强度以及抗降解能力，降低膨胀率，改善胶原蛋白的力学性能与抗水性。在临床应用中应用的形式有凝胶、水溶液、海绵、薄膜和颗粒剂等。并且正在研发的胶原蛋白药物缓释药物也都大部分集中在眼科中青光眼和抗感染治疗中，妇科的宫颈发育异常和外科的局部麻醉创伤中的局部治疗以及伤口修复的控制感染等14。 1.4 本文研究的内容 鲤鱼俗称鲤拐子，喜欢单独或成小群地生活于平静且丛生的泥底的池塘、湖泊、河流中。杂食性，掘寻食物时常把水搅浑，增大混浊度，对于许多动植物都有不利影响。因此，常被认为是不受欢迎的，人们要花很大力量才能除掉它。但同时它也是淡水鱼类中品种最多、分布最广、繁殖历史最悠久、产量最高者之一。其适应性强，耐寒、耐碱、耐缺氧。并且鲤鱼的鱼鳞和鱼皮中含有较多的胶原蛋白15。因此本实验主要集中研究了用胃蛋白酶提取鲤鱼鱼皮中胶原蛋白的提取条件，从而通过正交试验，找出最佳工艺条件，为胶原蛋白在生物方面、化妆品方面，食品方面等各个方面提供了物质基础，也可以让鲤鱼鱼皮更快的变废为宝。 2 鲤鱼鱼皮用酶法提取胶原蛋白的研究 2.1 实验材料 材料：鲤鱼鱼皮冷冻备用 试剂：胃蛋白酶，盐酸，氢氧化钠，蒸馏水等 仪器：752N型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、温度计等 2.2 鲤鱼鱼皮的预处理 将鱼皮上剩余的鱼肉切除，然后切成小片，用蒸馏水清洗干净，放在冷冻箱中进行保存16。 2.3 鲤鱼鱼皮胶原蛋白的提取将鲤鱼鱼皮进行预处理后，在4的条件下，用胃蛋白酶进行浸泡，这样就可以得到胶原蛋白的粗提取液17。 2.4 鲤鱼鱼皮提取胶原蛋白的单因素试验单因素包括酶的用量、提取时间、温度和pH。基本条件是加酶量75Ug-1，提取时间为8h，pH为2.0，然后通过各因素分别为25，50，75，100，125Ug-1，提取时间分别为4，6，8，10，12h，pH值分别为1.2，1.6，2.0，2.4，2.8，温度为29，33，37，41，45，每个实验重复三次，然后取平均值。 2.5 鲤鱼鱼皮胶原蛋白提取率的测定 胶原蛋白中含有大量的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等，其中羟脯氨酸在其他蛋白质中较为少见，为胶原蛋白所特有。因此通过羟脯氨酸的含量，就可以得出胶原蛋白的提取率18。 2.5.1 测定原理胶原蛋白在浓酸的条件下，经过高温长时间水解，彻底变成游离的氨基酸。其中的羟脯氨酸首先用氯胺T氧化生成含吡咯环的物质，然后以高氯酸溶液除去剩余的氯胺T，加入对二甲基氨基苯甲醛溶液作为显色剂，生成红色化合物，用可见分光光度计，在560nm处测吸光度，从而得到羟脯氨酸的含量。 2.5.2 试剂配制羟脯氨酸标准品；氯胺T溶液（0.05M）；过氯酸（3.15M）；柠檬酸缓冲液（pH6）；对甲氨基苯甲醛（用乙二醇甲醚配制）。氯胺T不稳定，要现用现配。 2.5.3 标准曲线绘制精密称取干燥至恒重的羟脯氨酸标准品50.0mg，用0.1M的HCl溶解并稀释至100mL（1mL相当于500ug），此为标准储备液。取上述标准储备液2.0mL加水稀释至100mL（1mL相当于10ug羟脯氨酸）即为标准应用液。取上述标准应用液0，0.2，0.4，0.6，0.8及1.0mL，分别置于10mL具有塞刻度的试管中用去离子水将各管体积调整为1.0mL。然后依次分别加入柠檬酸缓冲液1.0mL和氯胺T液1.0mL混匀后放置6min。再加过氯酸1.0mL混匀放置5min。各管加入p-DMAB液1.0mL后，混匀于75恒温水浴中放置10min迅速冷却至室温。以第一管作空白对照，于560nm波长测定吸收度，以羟脯氨酸含量为横坐标，吸收度为纵坐标绘制标准曲线。 2.5.4 样品的制备 称取2g样品于比色管中，加入6N盐酸20mL。加塞密封好后于125烘箱中水解4h，取出后冷却至室温。用10molL-1、1molL-1的氢氧化钠调节pH5-7，过滤后，滤液加水稀释至500mL，使稀释液中羟脯氨酸的浓度在010gmL-1范围内。 2.5.5 样品测定精密量取样品供试液200uL置于具塞刻度试管内，加水至1.0mL后，按上述标准曲线制备项下，自“加入柠檬酸缓冲液1.0mL”起，同样操作，由测得吸光度起从标准曲线计算样品中羟脯氨酸含量。以胶原蛋白中羟脯氨酸含量为13计，由此可得到样品中胶原蛋白的含量。 3 鲤鱼鱼皮用酶法提取胶原蛋白的结果与分析 3.1 羟脯氨酸标准曲线的绘制 测定不同浓度下的羟脯氨酸的A560值，以羟脯氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制出羟脯氨酸的标准曲线，求出回归方程，结果如下图：吸光度A560羟脯氨酸浓度/（gmL-1） 图1 羟脯氨酸 吸光度-浓度标准曲线 由图1可知，羟脯氨酸标准样品的回归方程为：Y=0.2713X+0.0047（R2=0.9991）。 3.2 胃蛋白酶的用量对胶原蛋白提取率的影响分别将胃蛋白酶的加量变为25Ug-1，50 Ug-1，75 Ug-1，100 Ug-1，125Ug-1，然后对鲤鱼鱼皮进行浸泡，之后测定胶原蛋白的提取率。胶原蛋白的提取率/（%） 胃蛋白酶的加量/（ug-1）图2 胃蛋白酶的加量对胶原蛋白提取率的影响 从图2得出，随着胃蛋白酶的含量的增加，胶原蛋白的提取率也增加，但是超过75Ug-1后，胶原蛋白含量提取率的增加也很缓慢。因此，从经济角度来看，胃蛋白酶的含量为75Ug-1最为合适。 3.3 胃蛋白酶的提取时间对胶原蛋白提取率的影响分别将胃蛋白酶的提取时间变为4，6，8，10，12h，然后对鲤鱼鱼皮进行浸泡，测定胶原蛋白的提取率，结果如下：胃蛋白酶的提取时间/(h)表3 胃蛋白酶的提取时间对胶原蛋白提取率的影响 从表3得出，随着胃蛋白酶胶原蛋白提取时间的变高，胶原蛋白的提取率变得越来越高，但是从8h后，随着胶原蛋白提取时间的增大，胶原蛋白的提取率有下降的趋势，因此，用胃蛋白酶提取胶原蛋白的最佳时间为8h。 3.4 pH值对胶原蛋白提取率的影响分别将pH值设为1.2，1.6，2.0，2.4，2.8，然后提取胶原蛋白，从而计算出胶原蛋白的提取率。图4 pH值对胶原蛋白的提取率的影响 从表4中可以得出在pH=2之前，胶原蛋白的提取率随着pH的增大而增大，而在pH=2之后，胶原蛋白的提取率不再随着pH的增大而增大，所以得出结论，在pH=2的时候，胶原蛋白的提取率最高。 3.5 提取温度对胶原蛋白提取率的影响 分别将提取温度设为29，33，37，41，然后提取胶原蛋白，从而计算出胶原蛋白的提取率，结果如下：图5 提取温度对胶原蛋白提取率的影响 从图5中可以得出在温度等于37之前，胶原蛋白的提取率随着温度的增大而增大，而在温度超过37摄氏度之后，胶原蛋白的提取率不再随着温度的增大而升高，所以可以看出，在温度等于37时，胶原蛋白的提取率最高。3.6 正交试验优化提取条件表6 正交试验结果试验号提取时间/（h） pH值温度/()加酶量/（Ug-1）胶原蛋白提取率/（%）171.8367530.70272387031.02372.2378031.45481.8388030.88582377531.67682.2367030.76791.8377030.79892368031.68992.2387530.72K193.1792.3793.1493.09K293.3194.3792.6292.57K393.1992.9393.9194.01K131.0530.7931.0531.03K231.1031.4530.8730.86K331.0630.9831.3031.34R0.050.660.430.48最佳条件823775 从表6中可以得出以下结论： （1）用胃蛋白酶酶提取鲤鱼鱼皮胶原蛋白的影响因素主要有酶的用量、提取时间、提取温度、pH值。 （2）通过极差分析中可以得到对于提取胶原蛋白的提取率的影响程度的大小依次为pH加酶量温度提取时间。 （3）用胃蛋白酶提取胶原蛋白的最佳条件为：酶蛋白酶的加量为75U/g,提取时间为8h，pH值为2，温度为37，此时胶原蛋白的提取率最高。 4 讨论 鲤鱼是在亚洲原产的温带性淡水鱼。 而且在鲤鱼中的蛋白质不但含量高，而且质量也很高，人体消化吸收率可达96%，并含有能供给人体必需的氨基酸、矿物质、维生素A和维生素D等人体所需元素。随着鱼类加工业的快速发展，产生了许多的下脚料，如果能够有效的回收，既可以增加增加经济效应，又可以减少环境污染。而在下脚料中又含有较多的胶原蛋白，特别是近几年来疯牛病、口蹄疫等传染病的发生与流行，使人们对来自于牲畜的胶原蛋白产生了怀疑。在这样的情况下，使得从鱼皮当中提取胶原蛋白的研究越来越多，但是普遍存在着提取时间过长，提取率过低的种种问题。 酶法是目前提取胶原蛋白最常用的方法，胶原酶对胶原蛋白以外的酶有抵抗作用，单独使用酶的研究比较少，大多是用酸或者碱或者是其混合物来提取胶原蛋白，而酸法或者碱法有其化学试剂，容易破坏其胶原蛋白的结构，因此，用酶法既环保又安全。 5 结论 从实验中来看，用酶法提取鲤鱼鱼皮胶原蛋白影响鲤鱼鱼皮胶原蛋白的提取率主要有酶的用量，提取时间，pH值和温度。通过极差分析可以得出对于提取胶原蛋白的提取率的影响程度的大小依次为pH加酶量温度提取时间。而且，用实验中可以得出用胃蛋白酶酶法提取鲤鱼鱼皮胶原蛋白的最佳工艺条件是酶蛋白酶的加量为75Ug-1，提取时间为8h，pH值为2，温度为37，此时胶原蛋白的提取率最高。参考文献 1程波，吴洁，张玉蓉. 酶法提取人工养殖鲟鱼鱼皮中胶原蛋白的工艺研究J. 食品研究与开发，2009，30（3）:1-42张俊杰，段蕊. 鲤鱼鱼皮胶原蛋白的提取及其性质的研究J. 氨基酸与生物研究，2008，30（1）：18-213黄石溪，陈桂平，罗灿，等. 酸法和酶法提取鱼皮胶原蛋白的工艺研究J. 农产品加工，2013，23（4）：44林琳. 鱼皮胶原蛋白的制备及胶原蛋白多肽活性的研究D. 中国海洋大学，2006,15（5）：12-155户业丽，吴洁，张瑞，等. ,酸法提取人工养殖鲟鱼皮中胶原蛋白工艺的研究D. 武汉工程大学和中国药科大学生命科学与技术学院，2007，16（2）:36张帅. 罗非鱼皮胶原蛋白提取及性质研究. 上海海洋大学，2010，30（3）:167M.D.fernandez-Daiz，P.Montero，M.C. Gomez-GuillunEffect of freezing fish skins on molecular and rheological propertics of extracted gelatinJ. Food Hydrocolloids，2003，17：281-2868户业丽，程波，吕中等. 人工养殖施氏鲟鱼组织中羟脯氨酸含量的测定J. 食品科技，2007，32（3）：227-2299任俊莉，付丽红，邱化玉. 胶原蛋白的应用及其发展前景(续)J. 中国皮革，20